Nucleic. Acids Res. | DeepAden: 基于深度学习的NRPS腺苷化结构域底物特异性预测方法

在天然产物研究中，非核糖体肽（NRP）是一类结构多样、活性丰富的重要天然产物，是临床药物先导化合物的重要来源。NRP的生物合成依赖于非核糖体肽合成酶（NRPS），其中腺苷化结构域（A domain）通过选择性识别和激活氨基酸底物来决定肽链核心结构。因此，准确预测A domain的底物特异性，对于理解NRP核心结构和生物合成逻辑至关重要。然而，现有预测工具面临两大瓶颈：一是基于单一共结晶结构（GrsA-Phe）定义的结合口袋残基在进化多样性A domain中的泛化能力有限，尤其是对非蛋白源底物的预测效果较差；二是底物数据严重不均衡，稀有底物样本匮乏，制约了模型的识别能力。

针对这些问题，近日，北京师范大学秦志伟团队在《Nucleic Acids Research》期刊上发表了题为“DeepAden: An explainable machine learning method for predicting the substrate specificity of nonribosomal peptide synthetases”的研究论文。该研究开发了DeepAden：一种两阶段深度学习模型，通过图注意力网络（GAT）精确定位结合口袋，结合对比学习实现口袋和底物跨模态对齐，并引入SHapley Additive exPlanations（SHAP）引导的数据增强策略缓解类别不均衡，为A domain底物特异性预测提供了新范式。

图1 DeepAden工作流程图

1.根据多样化结构集合重新确定结合口袋

传统的A domain底物特异性密码（10个关键氨基酸残基）和扩展的结合口袋（ABP，34个残基）均源于单一GrsA-Phe共结晶结构，对进化远缘A domain和非蛋白源底物的适用性有限。研究团队收集了10个A domain-底物共晶结构，系统比较了6 Å和8 Å两种距离阈值下的口袋定义。通过对所有结构取并集，定义了两套ABP：27-AA ABP（距离底物6 Å）和49-AA ABP（距离底物8 Å）。其中，27-AA ABP包含的残基全部被Rausch等人定义的34-AA ABP所覆盖，同时扩展了Stachelhaus等人定义的经典10-AA密码。进一步在4,545条A domain序列上的评估表明，基于6 Å的27-AA ABP集合恢复率为0.998，显著高于基于8 Å的49-AA定义（0.939），表明更紧凑的口袋定义更具一致性，更适合下游建模。

图2 基于10个共结晶结构定义的27残基A domain结合口袋

2.ABP-GAT实现了跨越进化距离的结合口袋预测

传统HMM方法依赖序列比对提取结合口袋残基，在进化远缘序列和非蛋白源底物上精度显著下降。为突破这一局限，研究团队利用78个A domain晶体结构训练了ResNet残差接触图预测器（F1 score = 0.965），再将预测的接触图作为图边信息、蛋白语言模型嵌入作为节点特征，构建了ABP-GAT图注意力网络模型。在留一法交叉验证中，6 Å ABP-GAT的平均残基级F1 score达到0.978 ± 0.033（95% CI: 0.970-0.985），显著优于8 Å模型（0.952 ± 0.068）。与基于1amu的HMM方法对比，ABP-GAT在所有序列相似度区间（0-60%）均保持高恢复率，而HMM在低相似度区间急剧下降；尤其在非蛋白源底物上，ABP-GAT表现远超HMM方法。这些结果表明，基于图结构的学习模型有效克服了进化分歧的影响，特别是在处理远缘A domain和非蛋白源底物时具有显著优势。

图3 ABP-GAT模型在结合口袋预测中的性能表现

3.SHAP引导的数据增强解决了数据不平衡难题

非蛋白源底物训练数据稀缺是制约预测精度提升的核心瓶颈。简单过采样或随机扰动不仅容易导致模型过拟合，还可能产生缺乏生物合理性的序列。为此，研究团队创新性地提出了SHAP引导的数据增强策略。该策略利用SHAP值量化结合口袋中各残基位点对底物识别的贡献：一方面可解释不同底物识别过程中的关键残基位点，另一方面可筛选出对模型预测贡献较低且更可能耐受突变的位点，并基于 BLOSUM 矩阵进行保守替换。通过在欠代表性底物的局部序列空间中引入生物学合理的保守突变，该方法在扩展训练样本多样性的同时，最大限度保留了关键底物识别特征，从而实现了具有生物意义的数据增强。五折交叉验证结果表明，SHAP 引导的数据增强将验证准确率提升至 90.57% ± 0.57%，较随机增强、简单过采样和无增强策略分别提高了 2.65%、9.19% 和 12.55%。

图4 A domain结合口袋的保守性和底物特异性决定残基

4.DeepAden底物预测性能表现优异

在对比学习框架下，DeepAden使用ABP-ESM2编码口袋表示、MoLFormer编码底物分子，通过跨模态对比学习将正样本对（口袋－底物）拉近、负样本对（口袋-非底物）推远，有效学习口袋－底物相互作用模式。在201条独立基准测试集上，DeepAden与近期发表的同类型工具NRPStransformer和PARAS对比：在整体的Top-3准确率上，DeepAden准确率为78.61%-87.56%，略优于两者2.5-3.3%。在不同同源性水平上，高相似度区间内，DeepAden准确率达85.48%，低相似度区间内，DeepAden准确率为44.44%；在不同类型底物的预测上，蛋白源底物三者表现相近；而非蛋白源底物上DeepAden显示出优势。进一步地，研究团队以水稻内生链霉菌Streptomyces hygroscopicus OsiSh-2为例，结合非靶向 LC-MS/MS 分子网络分析与 DeepAden 的 A 结构域底物预测，成功关联并注释了两个NRPS基因簇及其对应的nyuzenamide和octaminomycin类代谢产物，验证了DeepAden 在结构引导基因组挖掘中的应用潜力。

图5 DeepAden的模型评估

5.结语

本研究开发了一种基于深度学习的两阶段A domain底物特异性预测框架DeepAden。DeepAden在基准测试中达到与现有最优工具相当或更优的性能，尤其在低同源性和非蛋白源底物场景下表现出优势，为NRPS基因簇的功能注释和天然产物发现提供了实用工具，有望推动新NRP天然产物的发现与表征。目前在线服务器支持包括GBK和基因组输入形式的A-domain 底物预测。

北京师范大学副教授黄家权和在读博士研究生葛良军、吴亚新为本文第一作者，张鹤千副教授和秦志伟教授为通讯作者；来自中科中山药物创新研究院的孟松研究员对本项目中的机制解析工作做出了重要贡献；本项目受到国家自然科学基金、广东省自然科学基金、广东省重点领域研发项目、广东省人才项目的资助。

DeepAden在线服务器：https://deepnp.site/

附近期发表的相关工作：

1. Zhang Z, Zhou Y, Xie S et al. NRPStransformer, an accurate adenylation domain specificity prediction algorithm for genome mining of nonribosomal peptides. J Am Chem Soc, 2025; 147: 32662–70. https://doi.org/10.1021/jacs.5c08076

2. Terlouw BR, Huang C, Meijer D et al. PARAS: high-accuracy machine learning of substrate specificities in nonribosomal peptide synthetases. JACS Au, 2026; 6: 2315–36. https://doi.org/10.1021/jacsau.5c01636