Nat. Rev. Methods Primers | 面向G蛋白偶联受体的肽类配体发现

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G蛋白偶联受体是目前最重要、规模最大的治疗靶点类别之一，而肽类分子正在成为研究受体生物学和开发新药时越来越重要、也越来越灵活的一类配体。尽管许多核心药理学概念适用于所有配体类型，但近年来围绕肽类配体发展起来的一系列新方法，包括创新发现策略、组合肽库合成、计算设计以及结构信息整合，已经显著扩展了GPCR药物发现工具箱。本文概述了针对肽—GPCR相互作用的实验与计算流程，涵盖计算机内肽挖掘、孤儿受体去孤儿化策略、基于肽库的筛选平台、现代通路分辨型生物传感器实验，以及用于改善药代动力学局限的肽稳定化和优化策略。研究人员还总结了结构建模、基于扩散模型的从头设计、分子动力学模拟、自由能计算，以及人工智能或机器学习指导的筛选框架，这些框架正在将肽序列空间与受体结合和功能信号输出连接起来。与此同时，文章也讨论了该领域的关键挑战，包括可重复性问题、序列注释和翻译后修饰的不确定性、肽不稳定性、实验伪影以及当前计算挖掘方法的限制，并提出了相应改进策略。最后，研究人员展望了将实验药理学、结构生物学和计算建模整合起来的工作流，认为这种整合将加速下一代GPCR靶向肽探针和治疗性配体的发现。

G蛋白偶联受体是人体内规模最大、功能最多样的膜蛋白家族。超过800种GPCR能够介导细胞对多种细胞外刺激的反应，这些刺激包括光子、离子、气味分子、神经递质、脂质、氨基酸、肽和蛋白质。GPCR具有典型的七次跨膜结构，能够将配体结合事件转化为细胞内信号，主要通过异源三聚体G蛋白和β-arrestin实现。通过这些信号通路，GPCR参与调控神经传递、心血管功能、代谢和免疫等广泛生理过程。

GPCR之所以在生物医学中极其重要，一个关键原因是其高度可药物调控性。它们位于细胞表面，通常具有明确的细胞外正构结合口袋，在许多情况下还具有可被药理学利用的变构位点。GPCR也是构象高度动态的蛋白，能够在活化态、中间态和失活态之间转换。不同配体对不同构象的稳定作用，被认为是选择性激活细胞内信号通路的基础，这一现象通常被称为功能选择性或信号偏向。从进化角度看，GPCR几乎存在于所有真核生物谱系中，并可分为五大类：视紫红质样A类、分泌素样B1类、黏附型B2类、谷氨酸样C类和卷曲蛋白/味觉F类。不同类别在配体识别机制上有所差异，但共享相似的信号逻辑。

临床上，GPCR仍然是利用最广泛的受体类别。已有超过120种GPCR成为药物靶点，约三分之一获批药物作用于GPCR相关靶点。然而，在非嗅觉GPCR中，仍有相当大一部分尚未被充分探索，近百个受体仍被认为是孤儿受体，即尚未明确其内源性配体。结合计算预测、基因组与蛋白质组数据以及系统药理学分析的综合方法，正在不断扩展人们对GPCR功能的注释。

过去，GPCR药理学主要由小分子主导。小分子具有合成便利、化学稳定、口服利用度较好、膜通透性较强和生产成本较低等优势，因此构成了多数已获批GPCR靶向药物的主体。然而，结构和功能研究也揭示了小分子配体的内在局限。由于尺寸紧凑、相互作用表面有限，小分子有时难以在高度相近的受体亚型之间获得足够选择性，从而导致脱靶效应和交叉反应。此外，小分子通常作用于正构口袋或某个离散变构位点，往往不能充分利用GPCR较大的细胞外界面或影响受体构象和信号转导的次级结合区域。这一点在分泌素家族和黏附型GPCR中尤其明显，因为这些受体具有较大的细胞外结构域和复杂的结合拓扑。

正是对这种结构和功能复杂性的认识，使研究重心逐渐转向更大、更灵活的配体，尤其是肽和工程化生物分子。许多GPCR能够处于多个活化构象中，并优先耦合不同转导蛋白，从而产生信号偏向。能够选择性稳定这些构象的配体，为开发高度定制化药理探针和治疗药物提供了机会。目前已知超过100种GPCR可被内源性肽天然激活，这些受体主要分布在视紫红质家族和分泌素家族。肽类分子位于小分子与大型生物制剂之间，具有较大的接触表面、构象适应性和进化优化特征，因此常表现出较高亲和力和显著受体选择性。与多数小分子不同，肽可以同时接触正构和变构区域，形成双位点结合模式，从而促进部分激动、信号偏向或稳定特定受体构象。这些特性使肽不仅适合作为治疗候选物，也适合作为研究机制和解析孤儿受体的工具。

当然，肽类配体也面临固有药理学挑战，包括稳定性有限、口服利用度低和组织穿透能力不足。不过，肽化学和递送技术的进展已经明显缓解这些问题，尤其是在外周靶点中。动物毒液、植物肽和微生物肽代谢物等天然来源，提供了结构多样且高度选择性的GPCR配体宝库。结合肽组学、结构生物学和基于深度学习的设计技术，肽已经成为GPCR调控中越来越有吸引力的药物候选物和研究探针。

图1｜人类GPCR组及其主要信号特征。

实验方法

本部分总结并解释GPCR肽类配体发现早期阶段常用的计算和实验方法，同时概述肽设计策略以及用于将肽优化为具有药理应用价值的GPCR配体的化学流程。讨论内容包括基本原理、实践方法、可用工具和相关资源。

面向GPCR配体发现的天然肽多样性图谱

肽是生命各界普遍存在的信号分子，参与生殖、发育、激素调控、神经传递、防御、通讯以及宿主—病原体相互作用调节等多种过程。不断扩展的基因组和转录组数据表明，在蜘蛛、芋螺及其他海洋软体动物等富含肽的谱系中，可能存在数以百万计的肽。植物也被预测能够产生大量肽。然而，不同数据集之间对肽多样性的估计并不完全可比，因为报告的数量可能指的是独特成熟序列、近缘直系同源肽群、物种特异性出现的肽，或同一基础序列的不同翻译后修饰形式。随着大型测序计划和公共资源扩展，研究人员已经能够通过新的计算方法更加系统地探索广阔的肽空间。

尽管天然肽多样性巨大，目前已知天然产物GPCR配体仍主要由小分子占据，肽只占较小比例。这种低估预计将发生变化。已知天然GPCR肽配体还存在来源偏倚：肽主要来自动物、真菌或细菌，而植物过去更多被用于寻找小分子天然产物。尽管如此，迄今从自然界中分离出的约120种GPCR靶向肽中，已有若干进入药物或临床先导阶段。因此，肽类配体是一个关键但仍远未充分开发的GPCR配体发现来源，具有巨大的生物医学潜力。继续发现这类配体前景广阔，但也带来安全、伦理和环境方面的重要考虑，尤其是在全球生物多样性加速丧失的背景下。

内源性肽配体及其变体为GPCR药物发现提供了另一类互补且更可预测的资源，尤其是与人类GPCR具有明确同源关系的物种中的神经肽和肽激素。以已知可结合人类GPCR的约200种经典内源性肽为起点，跨物种搜索能够获得大量直系同源肽序列。除此之外，内源性GPCR肽配体的人群遗传变异仍是一个尚未充分开发的资源，可用于寻找处于正向选择下的突变版本。相比之下，毒性动物、昆虫、植物和微生物等生态专化生物产生的肽，常在捕食者—猎物或宿主—病原体情境中通过GPCR发挥作用，能够提供更偶然但机制上更具差异性的配体，并揭示全新的GPCR调控方式。

近年来，GPCR肽发现正在被新方法快速改造。全GPCR组筛选、生物混合物的活性指导分级，以及基于GPCR介导生理反应的功能实验，使研究人员能够检测低丰度、过去被忽略的GPCR活性肽。随着GPCR药理学越来越多地进入天然产物发现流程，并且研究焦点不再局限于小分子，肽类配体的发现速度预计将进一步加快。蛋白质组—转录组联合流程能够将质谱与转录组测序结合，扩展的基因组数据则提供接近完整的肽库，使研究人员能够从核苷酸序列直接预测成熟肽，并大规模探索肽多样性。

肽发现的计算方法

计算肽发现通常采用分阶段过滤流程，将庞大的序列空间逐步缩小到可进行结构建模和实验验证的候选集合。流程首先需要定义可搜索序列宇宙，例如基因组、转录组、蛋白质组或宏基因组，并利用索引搜索框架从大规模数据库中检索序列。相关工具可以将DNA、RNA和蛋白数据库转换为压缩且可搜索的表示，从而在超大规模数据集中快速识别肽样序列、保守基序和谱系特异模式。经过整理的肽数据库也可用于对搜索空间进行基准化，或为下游机器学习分析构建训练集和验证集。

在定义候选空间后，研究人员可以通过直接序列查询寻找肽样区域，或从较大前体蛋白中预测剪切产物。蛋白语言模型在这一阶段越来越有用，因为它们能够捕捉序列和结构上下文，为剪切预测、分泌筛选、从头结合分子生成，以及无比对结构推断提供可迁移表示。对于从前体序列直接预测成熟肽的任务，深度学习模型能够优先识别来自基因组或转录组输入的剪切产物。若蛋白酶特异性加工规则很重要，聚焦剪切位点预测的方法可以作为补充；在肽成熟依赖前激素加工的系统中，基于已知转化酶剪切模式训练的机器学习模型也可帮助优先筛选最可能成熟的产物。

候选肽随后应根据细胞外生物活性相关性质进行过滤，例如N端分泌信号、适当肽长、溶解度和稳定性，并排除具有强聚集倾向、极端疏水性或毒性相关基序的序列。由于许多生物活性肽还需要翻译后修饰，因此在这一阶段进行修饰感知的优先排序也很重要。最终输出是经过筛选的潜在生物活性肽集合，可进入肽—受体相互作用建模和实验筛选。然而，当前流程的持续性限制在于很难准确建模肽加工和成熟过程，因为这些步骤中的错误会继续传播到下游功能优先级排序中。

用肽组学验证和表征配体

肽组学能够直接从生物系统中发现、表征和验证GPCR活性肽，将复杂生物混合物与受体活性连接起来，同时对肽命中物进行高置信度结构注释。自然存在的肽池，例如来自分泌物、组织、毒液或微生物组来源提取物的肽，可通过固相萃取富集，再通过液相色谱分离，并用高分辨率质谱进行分析，以识别序列、定量丰度和解析关键翻译后修饰，如酰胺化、氧化和二硫键连接方式。这些修饰往往决定GPCR配体的效力和选择性。

质谱指导的分级可以与GPCR功能读出迭代配对，形成活性指导肽组学，用于追踪受体活性组分、解析复杂混合物并优先选择候选肽用于合成和后续实验。肽组学还能够与计算肽挖掘自然结合：计算方法从基因组或转录组预测分泌前体、剪切规则和修饰潜力，而质谱证据则验证哪些肽形式确实存在于生物样本中。这样，计算发现可以大规模提出候选物，而质谱确认其真实生物存在形式，从而显著减少计算发现中的假阳性。

基于随机肽库的肽发现方法

肽库筛选是发现和优化GPCR靶向肽类配体的核心策略。当已有结合基序和结构信息时，研究人员可以设计聚焦肽库，用于探索特定序列区域或侧链化学空间。当受体—配体信息较少时，完全随机肽库可以广泛采样序列空间。每个氨基酸位点的组合变化可产生超过十亿级随机序列，但其中通常只有极小一部分会结合特定GPCR。肽库生成和筛选主要分为两类：基于化学合成的方法，如高通量固相肽合成、膜阵列合成、单珠单化合物肽库和DNA编码肽库；以及生物展示系统，如噬菌体展示或mRNA展示。这些方法已经产生大量GPCR靶向肽激动剂、拮抗剂和变构调节剂，并相对于天然配体改善了药理和理化性质。

化学合成肽库在构建单元选择上具有极高灵活性，能够引入大量商业可得的Fmoc保护非天然氨基酸、多样化化学片段或定制单体。平行固相肽合成可在96孔或384孔板中自动化进行，并直接将粗肽用于GPCR激动或拮抗功能实验。更高通量的方法包括SPOT合成和分裂混合策略，例如单珠单化合物和DNA编码肽库，它们能够实现超过百万级不同肽序列的组合合成和亲和选择。

生物展示技术可以构建和筛选规模极大的肽库，通常包含数百万到数十亿个变体。每个肽与其编码DNA相连，亲和筛选后的肽可通过DNA测序识别。随机化肽区域通常由半随机化DNA寡核苷酸引入，并克隆到噬菌体质粒或mRNA展示线性DNA模板中。mRNA展示还可借助工程化tRNA—合成酶体系在无细胞翻译中引入非天然氨基酸。RaPID系统已被用于生成具有类药性质的靶向GPCR信号的大环肽。经过多轮针对固定化GPCR或受体结构域的淘选，具有更优亲和力或选择性的肽可被分离出来，并通过高通量DNA测序鉴定。

探索肽—受体相互作用的计算与结构方法

GPCR肽配体发现中的结构预测，现在已不再被视为一次性肽对接，而是一个迭代建模工作流。经典肽对接对GPCR尤其困难，因为肽具有大量可旋转键，并且结合时常诱导局部或整体构象变化。同源建模在存在近缘受体—肽复合物结构时有效，但在发现阶段常缺少这种先验结构，因此泛用性有限。当前工作流越来越依赖能从序列直接预测肽—蛋白复合物的深度学习方法，这些方法在许多情况下优于传统对接。

给定受体序列和预定义肽库或设计候选物后，研究人员通常使用AlphaFold-Multimer等方法预测受体—肽复合物，并使用预测局部距离差异测试、界面相关分数等内部置信度指标作为结合可能性的近似判断。这支持两个常见应用：从已有肽库中筛选和排序候选肽，以及利用AlphaFold预测指导从头肽设计。在这一框架下，结构预测成为设计循环的一部分，而不是单独建模步骤。

AlphaFold 2和AlphaFold-Multimer仍是核心工具。随后出现的AlphaFold 3、Chai-1和Boltz-2等工具进一步扩展了可处理的建模场景，例如纳入离子、修饰残基、小分子、多模态输入、实验约束、几何先验或结合亲和力评分。不过，最近一个涵盖GPCR—肽对的基准显示，AlphaFold 2在近期复合物正确结合模式再现方面表现仍然突出，并且通过局部相互作用重新评分可进一步提高配体富集效果。因此，有效的筛选流程已经从单纯对接转变为结构生成、置信度排序、局部相互作用重评分和迭代再设计的组合流程。

针对GPCR肽建模，还需要若干实用调整。由于GPCR存在多个构象状态，肽配体可能稳定不同活化或失活构象，而AlphaFold-Multimer并不能可靠建模特定活化状态，因此可以使用多状态建模协议，通过修改多序列比对或使用状态特异模板来引导采样。对于环肽建模，可在相对位置编码中引入环状偏移，以更合理处理受限肽拓扑。当需要更高结构准确度时，可通过大规模推理采样生成多个备选模型并提升平均模型质量。对于大型肽库筛选，可为受体一次性生成完整多序列比对，再与单序列肽输入配对，从而减少重复构建多序列比对的运行时间。

总体而言，GPCR肽发现的实用计算工作流已经形成：选择受体和候选肽集合，用基于AlphaFold的方法预测受体—肽复合物，利用置信度和界面指标排序，检查优先构象是否具有合理接触和状态兼容性，必要时进行局部重评分，并依据结构假设迭代改造或扩展肽集合。这样的序列优先工作流减少了对已知复合物结构的依赖，更适合发现应用，并能直接从预测结合模式生成机制假设。

图2｜用于发现和结构表征GPCR靶向肽的计算工作流。

分子动力学和自由能计算

肽与GPCR结合可通过经典分子动力学模拟和增强采样技术进行研究，两类方法在解析分子机制和构象转变方面互为补充。经典分子动力学可以在无外部偏置下探索肽在GPCR结合位点中的动态行为，并捕捉纳秒到微秒尺度的受体“呼吸”运动。这对表征局部结合稳定性、相互作用网络、水和离子效应特别有价值，也能够区分稳定与不稳定的肽结合姿势。对于肽诱导的受体活化或失活等罕见事件，经典分子动力学有时也可捕捉其一旦启动后的快速过程，但通常需要多个重复模拟来提高采样概率。

由于经典分子动力学难以充分收敛罕见过程相关的构象景观，研究人员越来越多地使用增强采样技术，例如监督或自适应分子动力学、元动力学、加速分子动力学、高斯加速分子动力学，以及结合集体变量的副本交换方法。这些方法旨在加速跨越能垒，以更高效采样肽结合或解离、受体活化等罕见事件。需要注意的是，这种加速通常带来取舍：许多增强采样方法并不保留无偏分子动力学的真实时间演化，因此不能直接解释为动力学观测。它们主要用于改善构象集合和热力学量的采样，或在方法允许时通过重加权恢复相关信息。

建立全原子分子动力学模拟系统时，通常需要先准备初始结构，选择或建模蛋白和肽，检查质子化状态并确保没有缺失区域。根据要模拟的过程，例如肽结合或肽诱导受体构象变化，可能需要先获得GPCR—肽复合物的初始近似结构，这通常来自对接或人工智能驱动方法。随后使用适当力场赋予系统参数，将受体—肽复合物嵌入类似细胞膜的脂质双层，加入显式水和离子，并根据实验条件调整膜组成和盐浓度。经过能量最小化和逐步平衡后，系统进入生产模拟，轨迹可用于分析结构动态、相互作用和构象变化。

分子对接和共折叠技术可快速生成GPCR—肽复合物模型，但它们难以准确预测配体亲和力和效能。分子模拟能够捕捉GPCR内在构象可塑性，并更真实地描述受体—肽复合物，包括脂质双层和水分子的贡献。不过，分子动力学计算成本较高，不适合筛选大型化学库，更适合用于阐明配体识别机制，并指导亲和力和效能优化。炼金术结合自由能计算已经在预测GPCR配体结合亲和力方面显示潜力，但对肽类配体而言，肽尺寸较大且构象柔性强，可能需要更长时间模拟才能获得收敛自由能估计。

现代肽—GPCR筛选实验

现代GPCR—肽筛选整合了多种互补体外实验，用以共同定义受体激活和下游信号。药理学已经从传统结合实验逐渐转向实时动力学测量，能够同时报告结合和解离速率以及平衡亲和力。功能实验则将结合数据与受体占有如何转化为细胞内信号联系起来，测量效价和效能，并分解单独信号通路，从而筛选信号偏向配体。虽然这些实验既适用于肽也适用于小分子，但由于肽药理学更复杂，因此尤其受益于现代实验格式提供的动力学和通路特异性分辨率。

活细胞生物传感器实验，如生物发光共振能量转移和时间分辨Förster共振能量转移，因为可在标准微孔板读数仪上运行，并能提供灵敏、稳健的配体—受体相互作用和下游信号读出，而被广泛使用。根据传感器放置位置不同，这些实验可以追踪转导蛋白结合或解离、受体构象变化、运输或内吞，以及第二信使动态，并可进行组合或多重化比较不同通路。相关工具包进一步推动了通路分辨型分析的标准化。需要警惕的是，组件过表达可能引入非生理性耦合或其他伪影。无标记替代方法可以使用天然受体，但通常需要更复杂的优化和分析。

由于肽药理学高度依赖肽完整性、实验格式和细胞背景，初始筛选命中物应通过分阶段验证流程推进，而不能仅依赖单一实验读出。在功能测试前，应通过液相色谱—质谱确认精确肽种类和纯度，包括序列、末端状态、关键翻译后修饰或化学替换，尤其是新合成或来源于肽库的配体。每个主要信号实验应至少配备一个机制不同的后续正交实验，因为没有一种单一实验能够完整覆盖GPCR药理学。

肽特异性伪影尤其需要注意。溶解性差、聚集、吸附到塑料表面、含血清培养基中的蛋白水解，以及长时间孵育中的浓度漂移，都可能产生与受体结合无关的表观活性差异。实际操作中可通过减少冻融、使用新鲜分装、优化缓冲液和载体添加剂、控制孵育时间，以及在不同板材和正交格式中复测命中物来降低这些问题。计算后续分析也应遵循类似分阶段逻辑：分子动力学或结构预测结果应被视为假设生成，除非它们在多个重复中呈现可重复相互作用模式、经过收敛性分析，并与实验突变或药理学结果一致。

结果

本部分讨论典型肽发现流程所产生数据的解释、评价和整合，以及发现有前景命中物后的先导优化阶段。重点包括天然肽发现可获得的洞察、高通量筛选的使用，以及通过肽化学修饰克服药代动力学限制。

利用遗传信息进行肽挖掘

目前覆盖生命各界的大规模基因组、转录组和蛋白质组数据，为发现新型生物活性肽配体提供了丰富但噪声很高的搜索空间。因此，高效流程对于降低假阳性、优先选择具有生物学合理性的肽，并指导实验验证至关重要。加工规则通常根据物种特异性剪切规律设定，但初始阶段常采用较宽松条件以避免漏掉非经典肽。仅这一步就可能产生数千到数百万个理论肽，因此下游过滤必不可少。常见过滤包括肽长度、预测分泌性、半胱氨酸数量和连接方式、净电荷或疏水性等理化性质。比较基因组学可进一步通过优先保留跨物种或跨分支保守的肽来降低噪声，同时保留可能反映适应性配体进化的谱系特异创新。翻译后修饰预测在该阶段尤其关键，因为遗漏酰胺化、焦谷氨酸形成或硫酸化等修饰，是下游实验假阴性的重要来源。

为了将肽候选物与受体谱系关联起来，计算模型可在多个层面发挥作用。序列相似性聚类和基序分析能够识别与已知GPCR配体相关的肽家族。更敏感的方法，如隐马尔可夫模型或基于嵌入的方法，可以发现简单基序搜索遗漏的更远缘关系。在受体侧，GPCR组系统发育重建可将搜索空间合理限制到已知能与肽相互作用的受体，例如A类肽受体或B类分泌素样受体。整个流程的核心挑战，是在灵敏度和特异性之间取得平衡。过强过滤可能丢弃真正的新配体，而过宽标准则会显著增加实验负担。因此，研究人员建议采用迭代策略，将广泛计算探索与由实验可行性和生物学相关性逐渐加强的过滤相结合。

用AlphaFold建模受体—肽复合物

AlphaFold会生成多个结构模型，并提供用于判断最高排序模型的置信度指标。这些分数是由模型训练数据驱动的预测，而不是统计学意义上的测量。主要指标包括预测对齐误差矩阵和预测局部距离差异测试分数。前者可用于推导整体置信度和链间取向置信度，也可计算更精细的界面相互作用指标；后者反映局部环境准确性，并可对界面残基或肽配体残基取平均后用于肽库筛选和从头设计评分。

更高级的深度学习肽筛选工具能够仅以靶蛋白氨基酸序列为输入，通过AlphaFold预测迭代优化肽种子序列，并根据结构置信度和界面距离进行选择。这些方法已经用于设计线性或环状肽，并成功获得靶向代谢相关GPCR的低纳摩尔效力肽激动剂。RFdiffusion骨架设计、ProteinMPNN序列设计和AlphaFold评分的组合，也可用于从头设计靶向GPCR的小蛋白激动剂和拮抗剂。机器学习指导的定量结构—活性关系预测与大型合成肽库结合，也展示了发现新型GPCR激动剂的能力。

分子动力学模拟的肽导向分析

生产模拟得到的轨迹能够全面分析肽—受体动态。研究人员可以同时检查系统多个方面。首先，可通过结构偏移指标评价肽波动，从而判断结合稳定性。其次，关键肽—受体接触残基及其相互作用频率尤为重要，因为它们能够区分持续、长寿命相互作用和高度瞬时接触。最后，分子动力学还能揭示肽结合如何稳定或重组受体内部相互作用。该信息对于理解肽如何稳定特定受体构象、驱动不同功能输出非常有价值，例如激动与拮抗、偏向信号与平衡信号之间的差异。分子动力学的优势在于能够以原子尺度连续监测配体诱导的构象变化及其导致的受体相互作用网络重组，从而帮助定位特定信号反应背后的结构决定因素。

肽—GPCR筛选中的数据分析和通路拆解

GPCR肽配体筛选旨在生成高质量、多维数据集，以量化肽如何作用于不同受体亚型和信号通路。结合和功能实验产生的原始数据通常由仪器专用或标准分析软件处理，并以内部标准归一化。随后通过曲线拟合获得亲和力、结合速率、效价和效能等参数。为处理统计变异，实验通常至少进行三次独立测量，并在每次实验中设置技术重复。突变体或受体缺失细胞系可作为阴性对照，已知参考配体可作为阳性对照。

随着人们对GPCR信号复杂性的理解加深，筛选越来越强调通路拆解。通常需要进行正交通路特异功能实验，例如G蛋白解离和β-arrestin募集。若要获得有意义的偏向量化，结果还必须使用通路特异参考模型拟合。将G蛋白亚型敏感格式纳入流程，可实现跨多个G蛋白家族的广泛信号谱分析。完整筛选得到的数据包括亲和力、结合速率、通路特异效能和效价；它们共同形成每个配体的独特“条形码”，可用于筛选理想药效学特征，例如解离较慢的动力学稳定性、高亲和力、对有益通路的选择性，或用于示踪剂的广谱结合能力。高通量和高内涵筛选平台，如微流控芯片和1536孔微孔板，正在使研究人员能够在整合流程中将大型肽库映射到GPCR组的广泛区域。

化学肽先导优化

尽管肽通常具有较高靶点亲和力和选择性，但其临床应用受限于药代动力学不佳、体内快速酶降解、膜通透性低和口服利用度极低。这些缺点源于肽高极性表面积、构象柔性、低亲脂性以及酰胺键易被蛋白酶切割。改善这些问题的化学策略主要围绕固相肽合成兼容修饰展开。N-甲基化可以减少氢键供体和极性表面积，并提高亲脂性。D-氨基酸替换可能改变构象并影响活性。逆反异构策略通过反转序列并替换为D-氨基酸来保留侧链拓扑。引入受限残基有助于探测GPCR结合口袋，提高亲和力或调节信号通路，同时改善稳定性。

大环化可预组织柔性肽，降低结合时的熵惩罚，提高GPCR结合能力和抗蛋白酶能力，也可能带来受体亚型选择性或信号偏向。订书肽通过侧链—侧链约束促进α螺旋形成，并增强膜通透性和稳定性。用保持几何和电子性质的肽模拟物替换特定酰胺键，也是提高稳定性的常用方式。这些修饰可将肽先导物推向更接近小分子“类药性”的性质，同时不牺牲效力。脂质化或PEG化也是经临床验证的策略，常用于延长循环半衰期并降低免疫原性。这些偶联物可可逆结合血清白蛋白，从而限制肾清除并提供抗蛋白酶保护。

化学修饰通常系统性引入命中到先导和先导优化阶段。进入临床试验的肽治疗药物整体成功率高于传统小分子，尤其在从II期进入III期阶段表现更好。这一趋势被认为源于其对生物靶点的高特异性、低毒性和相对可预测的代谢特征。

图3｜改善GPCR肽类配体药代动力学特征的常见化学策略。

肽—GPCR配体识别的互补发现路径和整合工作流

GPCR肽发现可以从不同起点展开，包括生物多样性来源的序列资源、受体结构信息，或实验可获得的肽库。因此，整体流程更适合被看作一组互补入口，而非单一线性管线。这些路径根据起始信息和发现逻辑组织，同时也可在实践中相互整合。计算方法可在多个阶段支持实验流程，包括肽库设计、候选优先级排序和后续分析，而所有路径最终都会汇聚到命中肽识别和潜在下游先导优化。路径选择主要取决于可用起始信息、资源条件和具体研究目标之间的平衡。结构指导发现能提供最详细的分子图景，但常依赖稀缺实验结构。天然肽提供大量候选物，但化学多样性可能受限。大型肽库可拓宽搜索空间，但通常需要大量实验努力和成本。

图4｜GPCR肽发现和优化的决策框架。

应用

本部分总结肽—GPCR配体在基础研究和治疗中的重要应用，并突出近十年来最重要和最成功的例子。

肽作为研究GPCR信号的探针

肽是信息丰富且用途广泛的GPCR生物学探针，可用于发现内源性配体、稳定特定受体状态以开展结构和机制研究，并在活体系统中以时空可控方式询问信号转导。

在肽—受体对的去孤儿化方面，天然和合成肽库的应用已经加速了潜在肽能GPCR与生物活性配体的系统配对。值得注意的例子包括从人血来源肽库中发现内源性CXCR4拮抗剂，以及从合成组合肽库中发现α-MSH相关分子、阿片受体拮抗剂和多巴胺D2受体调节剂。不过，初始筛选命中物需要多层验证才能确认真实受体—配体关系。初级活性通常通过通路特异功能实验检测，例如G蛋白激活或β-arrestin募集；对于具有组成性活性的受体，也可筛选反向激动剂或调节剂。随后，命中物需在正交实验系统中确认，如放射配体或荧光结合实验，以区分直接受体结合与下游或脱靶效应。进一步验证通常包括药理谱分析、跨受体面板的信号偏向和选择性评估，遗传手段如受体敲除、敲低或预测结合位点突变也可增强因果归属，生物物理和结构方法则提供机制洞察。

肽还可以作为构象稳定剂，将GPCR维持在特定状态以进行结构测定，并将效能差异或信号偏向等药理表型与其结构决定因素联系起来。早期结构显示，肽配体可以稳定细胞外结合状态，同时促进与活化样或失活样状态相关的不同细胞内构象。冷冻电镜进一步拓展了这一原则，使同一肽配体能够帮助捕获受体与不同转导蛋白或调控蛋白结合的结构，从而揭示转导蛋白选择性和信号偏向机制。除结构应用外，肽还可被工程化为状态选择性机制探针，例如模拟G蛋白C端螺旋、调节G蛋白构象口袋，或靶向GPCR二聚体界面。

当瞬时或无序接触难以通过结构方法解析时，光交联肽或同位素标记肽可作为互补工具，用于绘制结合位点和研究动态行为。光反应肽结合交联质谱，可以揭示受体无序区域中的瞬时接触；同位素标记肽则避免引入体积较大的光反应基团，更有利于保持天然结合和活性，并支持核磁共振、氢氘交换质谱、受体结合实验以及体内成像读出。

光笼化和光开关肽允许对GPCR信号进行时空监测和控制。光笼化肽在关键功能基团上安装光不稳定保护基，光照后不可逆移除保护基并恢复肽活性。光开关肽则引入偶氮苯等光开关基团，通过光诱导异构化触发可逆构象变化，调节肽活性。光响应肽可精确调控结合或信号性质，并实现对肽活性的光学控制。已有多种光笼化或光开关肽用于哺乳动物脑组织和体内系统，实现对GPCR功能的时间分辨测试。

图5｜肽作为研究探针用于发现、稳定、绘制和控制GPCR信号。

肽在诊断中的应用

肽配体越来越多地用于诊断，尤其是癌症成像。其高受体选择性和快速组织动力学，使其能够在体内灵敏且特异地检测GPCR表达。靶向CXCR4的放射标记肽已经进入血液肿瘤和实体瘤临床成像；靶向胆囊收缩素受体2的肽已成为检测甲状腺髓样癌的工具；神经肽Y类似物可支持Y1受体阳性乳腺癌成像；神经降压素示踪剂可用于可视化胰腺和结直肠肿瘤中的神经降压素受体过表达。此外，选择性靶向催产素受体的肽也成为激素依赖性癌症诊断工具的有前景方向。整体来看，这些例子说明GPCR靶向肽已从研究探针扩展为具有临床相关性的肿瘤诊断试剂。

用于GPCR调控的肽治疗药物

肽类药物已经成为现代GPCR药理学的重要组成部分，融合了天然配体的进化精准性和先进化学设计的可调整性。早期突破，如催产素、加压素和促性腺激素释放激素类似物，显示短肽和结构化肽可以作为高效且选择性的受体调节剂，并具有较好安全性。肽对受体的内在特异性和生物相容性，使其特别适合调节复杂信号系统。尽管酶不稳定和口服利用度低最初限制了治疗潜力，但合成化学和制剂技术的进步已延长其体内稳定性和活性，使其成为临床验证的GPCR靶向药物类别。

内源性肽激素及其衍生物是成功肽治疗药物的重要来源。GLP1类似物的成功就是典型例子。天然GLP1很快被二肽基肽酶IV失活，限制其治疗用途；通过结构指导修饰，包括N端替换、环化和脂质化增强白蛋白结合，研究人员开发出稳定的长效类似物，如利拉鲁肽和司美格鲁肽。口服司美格鲁肽使用吸收增强剂的制剂策略进一步证明，合理制剂可以使肽治疗药物经口给药后达到有效全身暴露。这类肽药物改变了代谢疾病治疗，使每周一次给药和更优血糖及体重控制成为可能，说明理性工程可以将不稳定内源性肽转化为重磅治疗药物。

天然肽骨架也是药物模板的重要来源。毒液来源毒素、植物环肽和微生物肽经过进化获得了许多合成框架难以达到的结构稳定性和受体选择性。这些分子具有较高构象刚性、抗酶降解能力和可调亲和力，能够作用于多种GPCR家族。一个著名例子是exendin-4，它是从希拉毒蜥毒液中分离出的GLP1样肽，后来成为首个获批用于糖尿病治疗的GLP1类似物。由于作为毒液成分进化而来，exendin-4对蛋白水解具有更强抵抗力，因此比天然GLP1更稳定。天然化合物的结构多样性，包括环状骨架、β折叠和二硫键，也使其成为工程化稳定、高选择性类似物的重要模板。

下一代肽工程和多激动剂设计正在推动GPCR肽药物进入新范式。基因组挖掘、从头设计和肽库方法加速了配体识别和优化。理性计算从头设计可以生成稳定且具有生物活性的肽，模拟天然骨架并展现理想药理特征。合理设计的GLP1、胃抑制多肽和胰高血糖素受体共激动剂，正在通过协调调节食欲、代谢和能量平衡引领这一新方向。这些分子说明，肽药物可以实现多数小分子难以达到的精准性和多靶点控制。未来，工程化多功能配体可能同时作用于多个受体或通路，从而获得整合生理效应；不过，这一策略目前在代谢疾病中最成熟，并不能替代对高度受体选择性配体的需求。

肽—GPCR配体的其他应用

在农业和害虫控制中，靶向昆虫GPCR的神经肽和肽激素配体正在被探索为高选择性生物杀虫剂，其脱靶毒性有望低于传统化学杀虫剂。在兽医学中，肽—GPCR配体已用于内分泌和生殖适应证，并作为长效激素类似物应用于伴侣动物和农场动物。在化妆品领域，GPCR靶向肽被作为功能性化妆品销售，例如声称可调节黑皮质素、阿片或乙酰胆碱相关信号以影响色素沉着、炎症或皱纹形成的神经肽样肽，不过这些应用往往缺乏严格药理学验证。

可重复性和数据沉积

本部分介绍如何查找和存放快速增长的GPCR与肽相关数据，并提出一套确保和提升实验可重复性的指南。

GPCRdb是一个持续更新的GPCR知识库，整合了GPCR序列、结构、突变和药理学信息，并支持分析、可视化和实验设计。其药物与配体部分聚合了具有来源记录的生物活性数据，为多数肽受体提供透明的跨数据库可追踪性。该数据库还提供偏向信号资源，可通过结构化模板提交偏向或平衡参考配体以及通路效应注释，从而支持标准化数据沉积和可重复偏向分析。IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology是专家整理的开放数据库，将包括肽在内的配体与分子靶点连接，并提供标准化命名和文献支持的活性数据，是GPCR药理学的权威参考之一。ChEMBL则是开放、专家整理的生物活性资源，标准化文献和捐赠数据集中的结构—活性数据，并记录具有明确序列的肽或生物治疗配体。BindingDB和PubChem等资源也可用于检索亲和力数据、上传筛选实验结果，并通过标识符支持透明和可重复的数据共享。

肽在GPCR研究中的扩展应用凸显了建立更清晰标准的重要性。肽药理学高度敏感于序列注释、化学修饰和实验背景，因此微小差异都可能产生截然不同的结果。数据沉积在该领域仍不一致。肽序列和结构信息，包括前体上下文、翻译后修饰或化学修饰，以及可用的三维结构，应存入可访问、机器可读的数据库，并明确链接到公共药理学数据归档。若序列、结构和功能数据分散或报告不完整，再分析、基准测试和重复使用都会受到阻碍。

最低报告标准应包括完整肽序列和修饰、受体物种和构建体、细胞系统、实验条件以及数据分析模型的明确披露。对于肽而言，这尤其重要，因为它们常表现出部分激动、信号偏向和非经典动力学，而这些性质又强烈依赖实验和系统背景。关键可重复性挑战包括序列误注释，尤其是翻译后修饰和半胱氨酸连接方式，以及由受体表达、信号机器和蛋白水解差异导致的细胞系依赖性。互补肽组学可以减少注释错误，但真正稳健的可重复性仍需要透明报告、参考配体、开放数据，以及在正交实验和不同细胞背景中的验证。

局限与优化

本部分概述肽类GPCR研究相关的关键转化与实验挑战，以及当前限制计算肽发现和肽—受体预测的方法学与数据驱动约束。

肽为GPCR药物发现提供了出色机会，但其理化性质可能使实验操作和转化应用复杂化。有限稳定性、快速蛋白水解和较差通透性常限制可用浓度窗口，并使结果异常敏感于处理方式和实验格式。即使可通过化学修饰或制剂策略改善稳定性和递送，体外肽行为仍可能是重要伪影来源。溶解性和聚集是常见实验瓶颈，可能导致非特异性结合、表面吸附以及随板材类型、缓冲液组成、孵育时间和混合方式变化的表观活性。因此，准确控制浓度、时间和实验条件至关重要。正交实验策略和功能读出有助于减少假阳性并提高可重复性。

计算发现肽配体和肽—GPCR配对也受限于生物复杂性和数据质量不均。基于基因组和转录组的挖掘可能受到碎片化组装影响，尤其是在只有草图基因组的非模式生物中，注释错误还可能产生截短或嵌合前体。深度学习和蛋白语言模型虽然拓展了搜索覆盖范围，但对短肽可能效果较差，并且训练偏向模式生物，限制跨界泛化，使许多非哺乳动物肽仍未被充分探索。自动基因组和转录组注释也是肽挖掘的重要瓶颈，因为短开放阅读框和微肽常被注释流程遗漏或降低优先级。为缓解这一问题，研究人员通常保留原始测序资源，并应用不依赖注释的流程直接挖掘组装片段。

另一个主要限制是预测前体与分泌成熟肽之间存在巨大差距。许多算法根据开放阅读框、信号肽和剪切基序推断候选物，但这些预测常具有物种特异性，并且经常高估生物活性产物数量。转录组表达并不保证肽会分泌或获得正确翻译后修饰，因此假阳性率较高。翻译后修饰进一步放大这一挑战，因为酰胺化、环化、硫酸化、糖基化和二硫键连接常决定肽生物活性和受体选择性，却很难仅根据序列上下文在非模式物种中可靠预测。因此，可扩展发现越来越需要将预测与质谱肽组学连接，并结合功能谱分析优先选择候选物，尤其是用于孤儿受体研究。

尽管深度学习结构预测已经进步明显，基于AlphaFold的方法仍存在重要限制。研究显示，AlphaFold-Multimer置信度分数在内源性配体与诱饵排序中表现具有明显靶点依赖性，即使通过局部相互作用重评分有所改善，许多靶点的真实内源性配体仍排名较低。此外，肽设计还面临缺乏多序列比对的问题，难以从肽序列中提取共进化信号。由于AlphaFold主要训练于预测折叠良好的蛋白静态构象，因此对无结构肽的建模仍然困难。通过谨慎解释内部置信度指标，并结合正交计算验证，可以显著减少假阳性。

展望

近年的方法学进展已经将肽GPCR研究从一个相对小众方向转变为成熟且面向未来的领域。结构、计算、化学和药理学工作流的整合，使系统发现和理性优化肽类配体达到了前所未有的精度。

肽药物正重新成为靶向GPCR的重要模态，这一趋势由结构生物学、计算方法和高通量药理学进步共同推动。肽—GPCR—转导蛋白复合物的冷冻电镜结构与分子动力学模拟结合，正在揭示肽如何稳定不同受体构象，并将信号导向特定通路。这些能量图谱可以指导设计，使研究人员更精细地控制效能、动力学和信号偏向。不过，将机制洞察转化为稳健且可比较的偏向量化仍然困难，因为测量强烈依赖实验背景、受体表达和时间分辨率。力场和增强采样策略的持续改进，正在缩小模拟行为与实验行为之间的差距，并有望解释大环化、脂质化或N-甲基化等修饰如何将短暂肽转化为稳定的偏向配体。

人工智能正在通过状态特异性受体模型、生成式肽设计以及面向选择性、抗蛋白酶能力和可开发性的多目标优化，加速肽—GPCR发现。人工智能生成序列随后可通过物理模拟和来自冷冻电镜或突变实验的结构约束进一步优化，从而在计算与实验之间形成连续反馈循环。机器学习驱动的共折叠和对接首次使大规模计算筛选肽与GPCR成为现实。未来进展将取决于肽—受体复合物预测准确性的提升，尤其是对构象集合、受体状态转换，以及膜环境和细胞内伙伴影响的捕捉，并取决于与分子动力学和自由能计算更紧密的整合。

发现空间也正在超越经典神经肽。翻译后修饰感知的肽组学能够捕捉对效力和选择性至关重要的内源性修饰，而跨物种基因组和转录组挖掘可发现新的前体和骨架。将生物多样性来源序列与基序搜索和隐马尔可夫模型搜索结合，已经把天然多样性转化为系统发现引擎。与此同时，肽响应GPCR的系统去孤儿化仍是重大且尚未充分开发的机会，尤其是黏附型GPCR等研究不足的家族。

药理学表征正在从单终点实验转向定量、通路分辨分析和基于下一代测序的一锅式多重方法。正交生物传感器能够并行测量G蛋白和arrestin耦合，无标记动力学系统则捕捉整合细胞反应。微流控平台减少试剂消耗，并允许对数千个肽变体进行时间分辨筛选。该领域需要标准化分析框架和参考配体，以确保信号偏向量化可重复，并促进共享数据资源。可互操作数据库和更好的数据协调，将是充分发挥机器学习方法作用的关键。

肽化学已经成熟为实用药物工程工具箱。大环化、订书化、引入非天然残基，以及通过脂质化或白蛋白结合延长半衰期等策略，已可常规提升稳定性、选择性和口服可用性。双位点配体和细胞内作用脂肽进一步扩大了设计空间。自动化合成和模块化架构使定制肽库可被快速组装，并用于高通量筛选，从而消除许多过去的实践瓶颈。现代肽—GPCR流程正在将生物多样性指导发现、人工智能和结构设计、自动化合成以及多重药理学整合为统一工作流。受体异源二聚体和混合信号复合物等新兴概念将继续扩展功能景观，并要求实验和计算框架超越单受体模型。建立社区标准、发展偏向量化方法以及预测性肽药代和药效模型，将加速发现向临床转化。总体而言，这些进展将使选择性强、稳定且具有信号偏向的GPCR肽调节剂从“可能实现”变成现代药物开发中的常规工具。

整理 | DrugOne团队

参考资料

Hermes, J., Matic, M., Yeung, H.Y. et al. Peptide ligand discovery of G protein-coupled receptors. Nat Rev Methods Primers 6, 52 (2026).

https://doi.org/10.1038/s43586-026-00503-5

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