Nature | 从纳摩尔到皮摩尔：RFdiffusion 如何设计高亲和力螺旋肽结合蛋白？

文献来源

论文题目：De novo design of high-affinity binders of bioactive helical peptides 期刊： Nature DOI： 10.1038/s41586-023-06953-1 通讯作者： Joseph L. Watson, Joseph M. Rogers, David Baker 发表日期： 2023年

导读

这篇 Nature 论文解决的是蛋白设计中一个非常具体但重要的问题：如何为短小、柔性、常在结合时才形成 α 螺旋的生物活性肽设计高亲和力、高特异性的蛋白 binder。传统抗体并不擅长识别延展的螺旋肽，而已有 de novo binder 设计更多面向结构稳定、表面相对固定的蛋白靶标。作者系统比较了参数化骨架设计、序列穿线、AF2 Hallucination 和 RFdiffusion 等策略，并重点展示 RFdiffusion 可以通过 partial diffusion 优化已有 binder，也可以从随机噪声直接生成皮摩尔级 PTH 和 Bim binder。更重要的是，这些 binder 不停留在计算指标上，而被用于 PTH 生物发光传感器和 LC–MS/MS 富集检测，显示出替代部分抗体试剂的潜力。

为什么这篇论文值得关注？

这篇论文值得关注，不只是因为它又一次展示了 RFdiffusion 的设计能力，而是因为它把 AI 蛋白设计推向了一个更接近真实生物检测和诊断应用的靶标类型：短肽，尤其是结合时形成 α 螺旋的柔性生物活性肽。

很多肽类激素在人体内具有明确的生理功能，例如甲状旁腺激素 PTH、神经肽 Y、胰高血糖素 GCG、促胰液素 SCT 等。它们常作为临床或生物医学研究中的重要检测对象。但这类靶标并不好做亲和试剂。原因很直接：它们短、柔、表面面积有限，在溶液中可能部分无序，只有结合受体时才形成稳定构象。抗体可以识别很多蛋白和小分子，但抗体的环区并不天然适合长距离包裹一条延展的 α 螺旋肽。论文也指出，几乎所有抗肽抗体倾向于识别非螺旋构象的肽，而不是完整包埋一条螺旋。

这正是本文的核心价值：它不是简单地为一个靶标做一个 binder，而是系统探索了螺旋肽 binder 应该长什么样、如何生成、如何优化、如何实验验证、如何转化为检测工具。

螺旋肽 binder 为什么难？

从蛋白设计角度看，螺旋肽 binder 难在三个层面。

第一，靶标不是刚性结构。许多生物活性短肽在游离状态下没有稳定三维结构，结合受体或其他蛋白时才形成 α 螺旋。这意味着设计者不能简单拿一个固定 PDB 结构当靶标，然后围绕它设计互补表面。靶标本身可能存在构象选择和诱导契合。

第二，相互作用面积有限。短肽可供识别的残基数量少，提供的疏水面、氢键位点和形状约束都有限。要获得高亲和力，binder 不能只形成几个局部接触，而要尽可能沿着整条螺旋建立连续界面。

第三，熵代价显著。如果短肽在游离状态下无序，结合时需要被固定成特定螺旋构象，这会付出构象熵代价。设计出来的 binder 必须提供足够多、足够匹配的相互作用，才能抵消这部分不利因素。

因此，这篇论文的任务不是一般意义上的蛋白 binder 设计，而是一个更苛刻的问题：在靶标柔性、界面狭长、熵代价存在的情况下，能否直接计算设计出高亲和力和高特异性的结合蛋白？

以往方法

可以把以往方法分成三类。

第一类是抗体和传统亲和试剂。 抗体的优势是成熟、可筛选、可工程化，但对螺旋肽并不总是理想。抗体结合位点主要由柔性环区形成，更擅长抓取凸起、口袋或局部表位；而螺旋肽是一条延展结构，需要长距离、连续、形状互补的结合槽。

第二类是传统计算蛋白设计。 Rosetta 等方法可以在给定骨架上设计界面侧链，也能做一定程度的骨架采样。但面对柔性短肽时，搜索空间很大：binder 骨架形状、肽构象、结合模式、界面侧链都要协同优化。若每个候选都依赖全原子松弛或深度构象搜索，计算成本会很高。

第三类是早期深度学习蛋白设计方法。 AF2 Hallucination 和 RFjoint Inpainting 已经可以从结构预测模型中反向挖掘设计能力，但 Hallucination 往往是在序列空间用 MCMC 搜索，计算效率较低，也容易产生对预测网络友好但实验不一定真实的 adversarial sequence。RFjoint 可以做结构补全和界面扩展，但它更多像是在已有设计周围做改造，未必能从头找到全新的结合拓扑。

RFdiffusion 的出现改变了这个问题的求解方式。它不是在序列空间慢慢试错，而是在结构空间通过扩散去噪生成可设计的蛋白骨架，再用 ProteinMPNN 做序列设计，并用 AF2 和 Rosetta 指标筛选。这使得作者可以直接探索与螺旋肽形状高度互补的 binder 骨架。

这篇论文的核心思想

这篇论文的核心思想可以概括为一句话：

要高亲和力结合一条螺旋肽，binder 不能只是碰到肽，而要像槽一样沿着肽的长度包裹它；深度生成模型的价值在于，它能直接围绕这条肽生成或微调这种形状互补的结合槽。

作者并没有一开始就只押注 RFdiffusion，而是构建了一条很有启发性的技术路线：

1. 1. 先用人类结构直觉设计 groove-shaped scaffold，也就是带开放结合槽的多螺旋骨架；
2. 2. 再用 RFjoint Inpainting 扩展弱 binder 的界面，提高接触面积；
3. 3. 用已有螺旋结合蛋白做 sequence threading，把目标肽序列穿到已有结合螺旋位置上，再重新设计界面；
4. 4. 用 AF2 Hallucination 在不指定肽结构的情况下，从目标肽序列出发搜索 binder；
5. 5. 最后用 RFdiffusion 做两件事：一是 partial diffusion 优化已有 binder，二是从随机噪声直接生成新的高亲和力 binder。

这条路线的重要性在于，它让读者看到 AI 蛋白设计不是魔法，而是一套逐步逼近问题本质的工程流程：先提出结构假设，再用生成模型扩大搜索空间，再用实验筛选和结构解析验证哪些改变真正提高了结合。

5. 方法细节：模型到底是怎么做的？

5.1 任务定义与输入输出

本文的任务是设计一个新的蛋白 binder，使其能够结合给定的生物活性螺旋肽。输入可以有三种形式：

第一种输入：已知螺旋肽结构。 例如 PTH 或 Bim 的螺旋构象可以作为固定靶标输入 RFdiffusion。模型需要生成一个新的 binder 骨架围绕这条肽形成结合界面。

第二种输入：已有弱 binder 复合物模型。 例如参数化设计或 RFjoint Inpainting 得到一个纳摩尔或微摩尔级 binder 后，partial diffusion 对这个复合物进行局部骨架重采样，使 binder 轻微改变构象，从而更好地包裹目标肽。

第三种输入：只有目标肽序列。 对于柔性肽，作者微调 RFdiffusion，使其能够在只知道目标肽氨基酸序列、不知道其结合构象的情况下，同时生成肽的结合构象和 binder 骨架。

输出则包括 binder 的骨架坐标、经 ProteinMPNN 设计的氨基酸序列、AF2 预测的复合物结构，以及实验可订购合成的候选序列。

5.2 数据表示：肽不是普通蛋白靶标

在 RFdiffusion 框架中，蛋白结构不是简单的 Cα 点云，而是以残基刚体框架表示。每个残基有平移和旋转自由度，扩散过程同时作用于三维位置和取向。原始 RFdiffusion 的前向过程会在 200 个时间步内逐步破坏残基的平移和方向，使其接近三维高斯分布和 SO(3) 上的随机取向；反向过程则学习从噪声恢复真实蛋白结构。

这对螺旋肽 binder 设计很关键。因为 binder 不是单纯要折叠成稳定蛋白，而是要在三维空间中把自身的螺旋、环区和侧链位置安排到目标肽周围。结构表示必须保留残基级空间关系，才能让模型学习到包裹、贴合、界面连续性这些几何特征。

对于只输入肽序列的场景，作者进一步修改训练策略：在 PDB 的单体和异源复合物上训练时，让模型看到某些区域的序列但看不到结构，使模型学习如何根据一段链的序列信息生成与之相容的结合结构。具体做法是：在部分训练样本中，对一条目标链的结构加噪，同时保留其序列；这样 RFdiffusion 学到的不是固定结构条件，而是从序列条件推断可能结合构象和周围 binder 结构的能力。

5.3 参数化 groove scaffold：先用人类结构直觉定义解的形状

作者首先提出一个很朴素但有效的结构假设：螺旋肽最好被一个开放的多螺旋槽包裹。这个槽由三条与目标肽接触的螺旋组成，外侧再用两条支撑螺旋稳定整体结构。

具体做法是使用 α 螺旋 coiled-coil 的 Crick 参数化方法，随机采样一批五螺旋骨架。参数包括每条螺旋长度、超螺旋程度、螺旋间距、相位、z 轴位移、支撑螺旋的径向偏移和倾角。作者先采样约 200,000 个五螺旋排列，再用 Rosetta ConnectChainsMover 把这些螺旋连接成连续骨架，得到约 135,000 个成功 scaffold，随后用 Rosetta 设计和过滤，最终形成约 18,000 个 groove scaffold 库。过滤指标包括每残基埋藏非极性表面积、Rosetta score、丙氨酸比例、暴露疏水残基、packing holes 等。

这个阶段的结果很有启发性：在 PTH、GCG、NPY 上，各筛选 12 个设计，确实有不少能结合，但亲和力主要停留在微摩尔级。说明结构假设方向正确，但纯参数化设计和传统界面设计还不足以获得高亲和力。

5.4 RFjoint Inpainting：把弱 binder 的界面扩展出去

接下来，作者用 RFjoint Inpainting 改造参数化得到的弱 binder。这里的逻辑不是重新生成整个蛋白，而是围绕已有 binder 做结构补全和界面扩展。

具体流程是：把 Rosetta 设计得到的 PTH、GCG、NPY 弱 binder 作为输入，让 RFjoint 在螺旋连接区加入随机长度变化，并重建其中一整条螺旋，以产生结构多样性；然后用 ProteinMPNN 重新设计序列；再用 AF2 initial guess 预测复合物结构并筛选。由于 RFjoint 本身较确定性，作者通过加入 loop junction 长度变化和重建整条螺旋来获得更多候选。

实验上，这一步明显提升了 PTH binder。作者测试 192 个设计，其中 44 个在酵母展示初筛中显示结合；经 SEC 纯化后，最佳设计用荧光偏振测得 Kd 为 6.04 nM，并且对相关肽 PTHrp 几乎无结合。相较初始弱 binder，亲和力提升约三个数量级。更关键的是，最佳设计的计算模型与靶肽接触表面积增加 19%；单纯用 ProteinMPNN 重设计原界面并不能显著提升亲和力，说明真正重要的是界面几何扩展，而不是只换几个侧链。

5.5 Sequence threading：把目标肽序列穿到已有螺旋结合界面上

另一路方法是 threading。作者从已有的全螺旋 scaffold 与单螺旋结合复合物库出发，把目标肽序列穿到原本被结合的螺旋位置上。然后筛选那些目标肽疏水残基能够与 scaffold 界面形成较多疏水接触的构象。

筛选后，作者用 ProteinMPNN 在目标肽存在的情况下重新设计 binder 序列，并用 AF2 initial guess 预测复合物。这个流程做两轮 ProteinMPNN 与 AF2 预测，并设置 gate filters，例如 interface pAE < 10、平均 pLDDT > 92、pTM > 0.8、输入骨架 RMSD < 1.75 Å。之后再结合 Rosetta ddG、contact molecular surface、膜插入倾向等指标筛选可订购序列。

这个方法在 SCT 上取得了不错结果。66 个设计中，酵母展示初筛识别出 4 个 binder；纯化后，4 个均达到亚微摩尔亲和力，最佳 SCT binder 的 Kd 为 2.7 nM。同时作者还获得了 GLP1 和 GIP 的 <100 nM binder。不过 SCT binder 对 GCG 也有结合，亲和力约弱 4 倍，说明 threading 能快速找到可用 binder，但特异性仍受目标肽序列相似性和界面预设结构限制。

5.6 AF2 Hallucination：只给肽序列，让模型搜索结合构象

Hallucination 的思路是反过来利用结构预测模型。不是输入序列预测结构，而是在序列空间中搜索那些被 AF2 预测为能够折叠并结合目标肽的序列。

作者以 Bid BH3 肽为模型靶标。输入包括 Bid 的一级序列和一个随机 binder 序列，binder 长度设为 60、70、80、90 或 100 个残基。然后进行 Monte Carlo 序列搜索，每一步改变若干氨基酸，用 AF2 model_4_ptm 预测复合物，按照损失函数接受或拒绝突变。损失项包括复合物 pLDDT、pTM、radius of gyration、接触概率和 interface pAE，权重大致为 1:1:0.1:3:5。轨迹共 5,000 步，早期每步允许更多突变以快速探索，后期减少突变进行精修，并优先修改 AF2 pLDDT 较低的一半残基。

Hallucination 的问题是容易产生预测网络偏好的 adversarial sequence。因此作者对 hallucinated backbone 再用 ProteinMPNN 设计 64 条序列，并用 AF2、Rosetta ddG 等指标过滤，最终测试 46 个设计。实验结果显示，其中若干 binder 可溶、单体表达，并能与 Bid BH3 肽结合；圆二色谱显示 Bid 肽游离时无序，结合后螺旋性增加；最佳 binder 的 FP 测得 Kd 为 7 nM，甚至强于 Bid 与天然伙伴 Mcl-1 的相互作用。

这说明只给目标肽序列，也有可能设计出结合诱导螺旋化的 binder。但 Hallucination 的计算成本和序列可靠性仍然是问题，因此 RFdiffusion 成为更核心的路线。

5.7 Partial diffusion：从已有 binder 附近寻找更好的骨架

Partial diffusion 是本文最值得细读的技术点之一。

标准 RFdiffusion 从随机噪声开始，经过约 200 步反向去噪生成蛋白结构。作者注意到，在反向去噪的中间阶段，结构已经不再是纯噪声，而像是最终结构的带噪版本。因此，如果我们有一个已有 binder 结构，就可以反过来做：先把这个结构加噪到某个时间步，比如 t=70，再从这个带噪结构开始去噪。这样生成的结构不会完全偏离原设计，但会在原骨架附近产生一组相关但不同的构象。

这解决了传统蛋白设计中的一个难题：如何在已有设计附近做骨架微调，而不是只改侧链。传统 Rosetta 或 MD 可以做局部采样，但如果要在结合界面周围大量探索，成本高且难以直接优化结合界面。Partial diffusion 则把问题转化为：在深度生成模型学到的蛋白结构流形上，对原始骨架进行可控扰动，再重新去噪生成仍然可设计、但界面可能更好的新骨架。

在实验流程中，作者对 GCG 和 NPY 的 Inpainted binder 做 partial diffusion，并在去噪过程中加入一个辅助势，最小化 binder–peptide 复合物的 radius of gyration，让整体更紧凑，促进 binder 与肽形成更多接触。每个靶标生成约 2,000 个 partially diffused designs，随后用 ProteinMPNN 设计序列，有的还经过 Rosetta FastRelax，再用 AF2 initial guess 预测结构，最后依据 AF2 pAE、pLDDT、设计模型 RMSD、单体 RMSD、Rosetta ddG 等指标筛到每个靶标 96 个设计。

结果非常清楚：GCG 起始 binder 为 231 nM，partial diffusion 后最佳 binder 达到皮摩尔检测下限以内；NPY 起始 binder 为 3.5 μM，优化后达到 5.6 nM。酵母展示初筛成功率也很高，96 个 GCG 设计中 25 个在 10 nM 肽浓度下结合，96 个 NPY 设计中 20 个结合。更重要的是，NPY binder 对序列同源性 63% 的 PYY 无可检测交叉反应，说明 partial diffusion 不只是增强疏水吸附，而是在一定程度上提高了可区分相似肽的界面匹配。

结构解析进一步说明了为什么它有效。作者解析了原始 Inpainted GCG binder 和 partial diffusion 后 GCG binder 的晶体结构，二者都与设计模型高度一致。Partial diffusion 只引入细小骨架移动，但这些移动足以让关键侧链重新占据更合适的位置。例如 binder 骨架向目标肽移动 2.7 Å，使 Ile13 能填入原来由 Phe 占据的口袋；另一个位置发生 3.6 Å 骨架移动，使 Tyr16 能在肽下方形成 packing 和氢键。结果是形状互补性从 0.62 提高到 0.67，接触分子表面积从 431 Ų 增至 522 Ų。

这部分的意义很大：AI 不是简单生成一个新结构，而是在实验验证过的设计附近做可解释的骨架级优化。

5.8 De novo RFdiffusion：从随机噪声直接生成皮摩尔 binder

在证明 partial diffusion 能优化已有 binder 后，作者进一步测试 RFdiffusion 是否能完全从头设计螺旋肽 binder。

固定结构版本中，作者提供目标肽的序列和螺旋结构，但不指定 binder 拓扑和结合模式。RFdiffusion 从目标肽周围的随机残基分布开始，在反向去噪中逐步把残基组织成能够包裹肽的折叠结构。每一步模型根据当前 noisy sample 预测最终结构，再向预测结构插值，生成下一步输入。图 3a 展示的就是这个过程：从围绕目标肽的噪声云，逐步生成一个 cradling peptide 的 folded binder。

作者对 PTH 和 Bim 各订购 96 个设计。PTH 中 56/96 在 10 nM 肽浓度下显示结合，最佳设计强到难以精确测 Kd，FP 给出 Kd < 500 pM 的上限；对相关肽 PTHrp 无可检测结合。Bim 中 25/96 结合，最佳设计同样 Kd < 500 pM。两者圆二色谱显示蛋白具有螺旋结构并在 95 °C 仍稳定。Bim binder 的晶体结构与设计模型非常接近，3.0 Å 分辨率下 RMSD 为 0.57 Å，并且设计中的跨界面氢键网络在结构中得到复现。

这部分是全文最强的证据之一。因为这些 binder 不是经过体外定向进化得到的，而是直接计算设计、订购基因、表达纯化后达到皮摩尔级别。作者认为 PTH 和 Bim binder 是直接计算设计且无后续实验优化条件下，对任意靶标达到的最高亲和力 binder 之一。

5.9 只输入序列的 RFdiffusion：面向柔性靶标的更一般版本

固定结构设计仍然依赖一个目标肽构象。但很多肽没有可靠结构，或者与不同伙伴结合时构象不同。因此作者微调 RFdiffusion，使其能从目标序列出发设计 binder。

训练时，模型使用 PDB 中的单体和异源复合物。对于部分样本，模型看不到目标链结构，只看到目标序列；另一条链作为 binder chain。这样模型学习到：当只知道目标序列时，也可以生成与其相容的目标构象和 binder 结构。

作者用 PYY 测试这一版本。PYY 在 NPY Y2 受体复合物中的结构并不完整，呈部分螺旋。只输入 PYY 序列后，RFdiffusion 生成了一系列不同构象方案，其中一个设计让 PYY 采用不同于已知受体复合物的构象，并实现 24.5 nM 亲和力，对 NPY 无可检测结合。这个亲和力低于固定结构版本的皮摩尔 binder，作者也指出可能与使用更短 binder 链长有关，但它证明了一个关键方向：binder 设计可以不再完全依赖预先给定的目标肽结构。

6. 实验设计与关键结果

这篇论文的实验设计很完整，主要证据来自四个层面。

第一，体外结合验证。 作者使用 NanoBiT split-luciferase、酵母展示初筛、荧光偏振 FP 等方法逐步验证设计是否结合目标肽，并测定 Kd。核心结果包括：RFjoint Inpainting PTH binder 达 6.04 nM；Hallucination Bid binder 达 7 nM；partial diffusion GCG binder 达皮摩尔级，NPY binder 达 5.6 nM；de novo RFdiffusion PTH 和 Bim binder 均达到 Kd < 500 pM。

第二，特异性验证。 作者不仅测目标肽，也测相关肽。例如 PTH binder 对 PTHrp 无明显结合，NPY binder 对 PYY 无可检测交叉反应，PYY binder 对 NPY 无可检测结合。这一点对诊断试剂尤其关键，因为同一家族肽往往序列相似，误识别会直接影响检测准确性。

第三，结构验证。 GCG binder 的 Inpainted 版本和 partial diffusion 版本均解析晶体结构，并与设计模型高度一致；Bim binder 也解析晶体结构，RMSD 仅 0.57 Å。这说明模型生成的界面不是只在 AF2 中好看，而是能在真实晶体结构中复现关键几何特征。

第四，应用验证。 作者把 PTH binder 接入 lucCage 生物发光传感器，筛选 8 个设计后获得 PTH 响应传感器，LOD 为 10 nM，PTH 存在时发光增强约 21 倍。作者还把 PTH 和 GCG binder 固定到磁珠上，用于 LC–MS/MS 前的亲和富集。PTH 在 buffer 和加标人血浆中的回收率分别为 53% 和 43%；GCG binder 在 buffer 中达到与单克隆抗体相当的捕获效率，且重复使用后仍保留几乎全部活性，而抗体珠第二次使用时几乎丧失活性。

这组实验使论文超越了纯方法展示。作者不仅证明能设计 binder，还证明这些 binder 可以被转化为检测模块、富集试剂和潜在诊断工具。

7. 这篇文章的真正启发

第一，螺旋肽 binder 的关键不是单点相互作用，而是长程界面互补。 这篇文章反复证明，亲和力提升往往来自接触面积、形状互补性和界面连续性的增加，而不是简单换几个氨基酸。

第二，partial diffusion 是蛋白设计中的骨架级局部优化工具。 它给了设计者一种介于固定骨架侧链重设计和完全从头生成之间的路线：在已有设计附近探索可设计的结构邻域。

第三，RFdiffusion 的优势不只是生成漂亮结构，而是能够直接 build to fit。 对螺旋肽这种狭长、柔性、难包裹的靶标，生成模型可以围绕目标形状构造新骨架，而不是从已有骨架库中勉强匹配。

第四，AI 蛋白设计正在从结构任务进入试剂工程任务。 本文的应用对象不是药物靶点阻断那么单一，而是生物标志物检测、MS 富集、传感器构建。这可能是 AI 设计蛋白更快落地的方向之一。

局限性

首先，靶标类型仍较集中。本文主要围绕形成 α 螺旋的短肽，且 binder 多数仍收敛到全螺旋 groove scaffold。对于 β 构象肽、无规则长肽、翻译后修饰肽、多构象肽，方法是否同样有效还需要验证。

其次，只输入序列的柔性靶标设计还没有达到固定结构条件下的亲和力水平。PYY 序列输入版本达到 24.5 nM，这已经很好，但与 PTH、Bim 的 <500 pM 相比仍有距离。说明当目标构象未知时，模型需要同时解决肽构象建模和 binder 设计两个问题，难度明显更高。

第三，实验筛选仍不可或缺。虽然最佳 binder 是直接计算设计得到的，但每个靶标仍通常订购几十到近百个设计，并通过酵母展示、表达纯化、FP 等步骤筛选。对于工业化或临床诊断开发来说，后续还需要系统评估批间稳定性、复杂基质干扰、长期保存、生产成本、法规质量控制等。

第四，特异性仍需在更大相关肽面板中验证。本文对 PTHrp、PYY、SCT、NPY 等做了重要对照，但临床样本中存在大量同源肽、降解片段、修饰形式和蛋白背景。一个 binder 在少数近缘肽中表现特异，并不等于在真实血浆或组织液中一定足够干净。

第五，LC–MS/MS 应用仍处在概念验证阶段。PTH 在加标血浆中可回收，但内源水平太低尚无法可靠检测；GCG 在 buffer 中表现好，但在复杂 extract 中回收较低，作者也承认需要进一步提高特异性。这说明 designed binder 替代抗体还不是一步到位，而是需要面向具体检测流程继续工程化。

对 AI 制药未来发展的意义

这篇论文对 AI 制药的启发，不应只理解为 RFdiffusion 又做出了一个高亲和 binder。更重要的是，它提示了一个更现实的发展方向：AI 设计蛋白可能首先在高稳定性亲和试剂、诊断捕获试剂、传感器模块和功能性研究工具中快速落地。

相比治疗性蛋白，诊断试剂的开发门槛可能更适合计算设计快速迭代。设计 binder 可以在 E. coli 中低成本表达，热稳定性高，易于融合到传感器系统，也可以固定到磁珠、柱材料或检测芯片上。对于抗体难获得、稳定性差或批间差异大的靶标，de novo binder 有实际替代空间。

从方法学上看，partial diffusion 也很可能成为未来蛋白工程中的通用模块。很多已有蛋白、天然结合蛋白、弱设计 binder 并不需要完全重做，而是需要局部骨架微调来改善界面。Partial diffusion 刚好提供了这种可控扰动能力：保留原有拓扑，探索周围结构邻域，再用 ProteinMPNN 和 AF2/Rosetta 筛选。这与药物化学中的 hit-to-lead 优化有相似之处，只不过优化对象从小分子骨架变成了蛋白骨架和界面几何。

更远一点看，只输入序列的 RFdiffusion 代表了一个重要方向：模型不再依赖一个确定的靶标结构，而是能够处理目标本身的构象不确定性。对许多 intrinsically disordered regions、短线性 motif、肽激素和变构片段来说，这可能比固定结构 binder 设计更接近真实生物学。

1. Partial diffusion 给蛋白设计带来了一种新的优化方式：在已有结构附近搜索更可结合、更可设计的骨架。