Nat. Chem. Biol. | 蛋白质稳定性主要由单位点偏倚而非位点间协方差决定

近年来，基于多序列比对的Potts模型被广泛用于蛋白质设计和突变效应预测。传统观点认为，多序列比对中既包含单位点保守性，也包含残基之间的协同进化信息，两者共同决定蛋白质结构、稳定性和功能。因此，大多数基于Potts模型的设计策略都会同时优化单位点偏倚和位点间耦合项。然而，两类信息对于蛋白质稳定性的具体贡献一直缺乏直接实验验证。

研究人员利用Potts模型分别构建仅保留单位点偏倚、同时保留单位点偏倚与位点间协方差，以及部分保留协方差等多种设计策略，并针对同源异型盒结构域以及三类酶蛋白开展系统实验比较。结果发现，仅优化单位点偏倚设计得到的蛋白质具有最高热力学稳定性，而加入位点间协方差信息反而降低了稳定性。相反，协方差信息对于酶催化活性具有明显促进作用。研究进一步说明，多序列比对中的协同进化模式更多反映功能约束，而非稳定性约束。该工作提出了一种新的蛋白质设计理念，即在提高稳定性时优先优化单位点偏倚，再适度引入有限协方差信息以恢复功能，为高稳定性蛋白设计提供了新的理论依据。

蛋白质能够折叠形成稳定的三维结构，并完成催化、结合、信号转导等复杂生命功能。长期以来，研究人员认为蛋白质序列中的协同进化关系反映了不同残基之间的相互作用，因此多序列比对中的位点协方差一直被认为是蛋白质折叠和功能的重要信息来源。

统计耦合分析和直接耦合分析等方法已经证明，位点间协同变化能够用于预测蛋白质结构接触关系，并提高突变效应预测和蛋白质设计性能。基于Potts模型建立的统计能量函数同时包含单位点偏倚和位点间耦合，因此近年来逐渐成为蛋白质设计的重要工具。

另一方面，不依赖协方差的祖先序列重建和一致性设计同样取得了巨大成功。这些方法仅依据每个位点最常见的氨基酸进行设计，却能够得到稳定性往往超过天然蛋白质的新序列。这一现象提示，单位点偏倚可能已经包含了大量与稳定性相关的信息，而位点协方差是否真正提高稳定性仍值得重新检验。

为了回答这一问题，研究人员将单位点偏倚与位点协方差在Potts模型中完全分离，并设计了一系列不同能量函数控制的新蛋白，直接比较两类信息对蛋白质稳定性和功能的贡献。

方法

研究人员首先收集同源异型盒蛋白以及腺苷酸激酶、二氢叶酸还原酶和磷酸甘油酸激酶四个蛋白家族的大规模多序列比对，并利用Potts模型分别推断单位点偏倚参数和位点间耦合参数。同时，又建立仅包含单位点偏倚的独立模型作为对照。

随后，研究人员构建了多种不同能量函数，包括仅优化单位点偏倚、同时优化单位点偏倚与全部协方差、仅保留最强协方差、仅保留空间邻近协方差以及一致性模型等，并采用蒙特卡洛模拟独立生成大量低能量蛋白质序列。筛选代表性序列后，通过基因合成、蛋白表达和纯化，分别利用圆二色谱、盐酸胍诱导变性、等温滴定量热和酶动力学实验测定其折叠稳定性、DNA结合能力及催化活性，从而系统比较不同设计策略的性能。

结果

Potts模型实现单位点偏倚与协方差的独立设计

研究人员首先建立了完整Potts模型，同时得到单位点偏倚参数和位点间耦合参数，并进一步建立只保留单位点偏倚的独立模型。

为了比较两类信息的贡献，研究人员分别构建五种能量函数。其中一种仅包含单位点偏倚，另一种同时包含全部协方差信息，还有两种仅保留最强协方差或空间上最邻近的协方差，最后一种对应传统一致性设计。

通过蒙特卡洛优化，每种策略分别生成1000条低能量序列。结果显示，仅优化单位点偏倚得到的序列具有最低的单位点能量，而同时优化协方差得到的序列则具有最低的协方差能量，两类序列形成明显不同的统计分布。值得注意的是，完整Potts模型生成的序列还形成两个不同聚类，说明协方差不仅影响成对残基关系，还诱导更高阶的序列关联。

相比之下，仅优化单位点偏倚得到的序列不存在这种双峰现象，提示单位点信息能够独立决定大量序列特征，而无需依赖复杂协同变化。

图1: 基于Potts模型的蛋白质设计流程及不同能量函数构建策略。

单位点偏倚设计产生稳定性最高的蛋白质

研究人员首先利用同源异型盒蛋白验证不同设计策略。所有设计蛋白均能够正确表达，并形成典型α螺旋结构。随后利用盐酸胍诱导展开实验测定折叠自由能。

实验结果出乎预料。虽然同时优化单位点偏倚和协方差得到的蛋白比天然蛋白更加稳定，但稳定性最高的并不是完整Potts模型，而是仅优化单位点偏倚得到的蛋白。

天然蛋白平均折叠自由能约为−3.9 kcal/mol；完整Potts模型设计蛋白平均约为−8.2 kcal/mol，而仅优化单位点偏倚后，稳定性进一步提高至约−14 kcal/mol，几乎比天然蛋白增加10 kcal/mol以上。

一致性设计同样获得较高稳定性，但仍低于单位点偏倚优化策略。这说明传统一致性设计虽然能够提高稳定性，但由于其中仍不可避免保留部分协方差信息，因此未达到理论最优。进一步分析发现，蛋白稳定性与单位点能量之间呈显著正相关，而与协方差能量之间仅表现较弱相关。

图2: 不同Potts设计策略生成蛋白序列的统计特征及能量分布。

协方差信息并不是稳定性下降的噪声来源

研究人员进一步提出一种可能性：协方差项数量远多于单位点项，因此稳定性下降可能只是由于大量微弱耦合产生噪声。

为了验证这一假设，他们仅保留协方差矩阵中最强10%的残基对，或仅保留空间距离最近10%的残基对重新进行设计。结果显示，两种策略确实比完整Potts模型稳定性略高，但仍明显低于纯单位点设计。

说明问题并不来自弱协方差噪声，而是位点协方差本身会削弱单位点偏倚带来的稳定作用。研究人员随后改变Potts模型中的正则化参数和序列重加权参数重新拟合模型。

无论模型参数如何变化，实验结果均保持一致：单位点偏倚始终产生最高稳定性，而加入协方差后稳定性再次下降，证明这一结论具有较好的稳健性。

单位点偏倚决定稳定性而非协方差

为了进一步量化不同因素的重要性，研究人员汇总所有设计蛋白，共分析60余个蛋白样本。相关分析发现，折叠自由能与单位点能量之间具有很强相关性，而与协方差能量之间仅存在较弱负相关。

进一步采用偏相关分析后发现，当去除单位点能量影响后，协方差几乎不再与稳定性相关；相反，即使控制协方差影响后，单位点偏倚仍保持很强预测能力。这说明协方差与稳定性的相关主要来自其与单位点偏倚之间存在统计关联，而不是直接决定蛋白稳定性。

因此，对于Potts模型设计而言，真正决定热力学稳定性的主要因素是单位点偏倚，而非协同进化产生的位点耦合。

图3： 不同设计蛋白折叠稳定性及其与单位点偏倚、协方差能量之间的关系。

多种酶蛋白验证单位点偏倚规律具有普遍性

为了验证这一规律是否具有普遍性，研究人员继续分析腺苷酸激酶、二氢叶酸还原酶和磷酸甘油酸激酶三个完全不同的酶家族。三类蛋白均采用相同设计流程。实验结果与同源异型盒蛋白高度一致。

对于三个蛋白家族，仅优化单位点偏倚得到的蛋白均表现出最高变性中点和最高热稳定性；一致性设计位于中间；完整Potts设计稳定性最低。对于磷酸甘油酸激酶，由于展开过程具有多个中间态，研究人员进一步采用多状态模型拟合，同样得到一致结论。

说明单位点偏倚决定稳定性这一规律并非特定蛋白家族现象，而具有较好的普适性。

协方差主要提高蛋白功能而非稳定性

既然协方差不能提高稳定性，那么它究竟承担什么作用？研究人员进一步测定蛋白功能。对于同源异型盒蛋白，采用等温滴定量热法测定DNA结合能力。结果显示，仅优化单位点偏倚得到的蛋白具有最高DNA结合亲和力，并明显优于完整Potts设计。然而，在三种酶蛋白中，情况恰好相反。完整Potts设计得到的蛋白均具有最高催化效率，其催化速率接近天然酶；而仅优化单位点偏倚得到的蛋白催化能力明显下降。

说明位点协方差虽然不能提高热力学稳定性，却保存了催化活性所需的重要协同作用。研究人员因此认为，多序列比对中的协同进化关系更多反映蛋白质功能约束，而不是折叠稳定性约束。

图4: 不同Potts设计策略下同源异型盒蛋白稳定性及DNA结合能力分析。

图5: 腺苷酸激酶、二氢叶酸还原酶和磷酸甘油酸激酶的展开实验比较。

图6: 不同设计策略下DNA结合能力及三类酶催化活性比较。

讨论

长期以来，人们普遍认为，多序列比对中的位点协方差记录了蛋白质折叠过程中重要的相互作用，因此应该有助于提高蛋白稳定性。本研究首次通过系统设计实验，将单位点偏倚和协方差信息完全分离，证明二者承担着不同生物学功能。

研究结果表明，单位点偏倚决定了蛋白质热力学稳定性，而位点协方差更多反映催化、结合和其他功能约束。当两类信息发生冲突时，协方差甚至可能降低稳定性。

这一发现也解释了为什么一致性设计和祖先序列重建等仅依赖单位点频率的方法，能够持续获得高度稳定的蛋白质。虽然这些方法没有显式利用协方差信息，却已经捕获了稳定性最关键的统计规律。

与此同时，本研究也重新定义了Potts模型在蛋白设计中的应用方式。传统Potts设计通常同时优化单位点和协方差，而未来更合理的策略可能是首先利用单位点偏倚获得最高稳定性的骨架，再根据具体功能需求，仅引入少量关键协同进化残基恢复催化活性或结合能力，从而突破传统稳定性与功能之间的折中关系。

研究人员还指出，协方差可能主要参与维持蛋白质折叠协同性、多状态构象转换以及复杂催化过程，而不仅仅是稳定天然构象。因此，未来蛋白质设计应分别建模稳定性约束和功能约束，而不是简单将两类统计信息等权优化。

总体而言，该研究挑战了长期以来关于协同进化信息作用的传统认识，提出蛋白质稳定性主要来源于单位点偏倚，而位点间协方差主要负责维持生物学功能这一新的理论框架，为下一代AI蛋白质设计和超稳定蛋白工程提供了新的设计原则。

整理 | DrugOne团队

参考资料

Sternke, M., Tripp, K.W., Behera, S.P. et al. Protein stability is determined by single-site bias rather than pairwise covariance. Nat Chem Biol (2026).

https://doi.org/10.1038/s41589-026-02270-6

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