Nat. Methods | 人类蛋白质亚细胞定位序列预测方法的综合基准评测

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蛋白质亚细胞定位决定了蛋白质发挥功能的空间位置，也是解析蛋白质功能、相互作用网络以及疾病机制的重要基础。近年来，大量基于蛋白质序列的亚细胞定位预测模型不断涌现，但现有评测通常存在测试集规模较小、亚细胞分类粒度较粗以及仅支持单标签预测等问题，而事实上约一半的人类蛋白质具有多亚细胞定位特性。研究人员整合 UniProt、Human Protein Atlas（HPA）和 OpenCell 三个权威数据库，构建了包含3,814个人类蛋白质的高可信度基准测试集，其规模约为现有标准测试集的两倍。基于该数据集，研究人员系统评测了主流序列预测模型以及不同蛋白质语言模型和特征聚合策略。结果发现，目前模型在精细亚细胞结构、多定位蛋白以及因致病突变导致定位改变的蛋白质预测方面仍表现有限，说明序列信息本身尚不足以完全解决蛋白质定位预测问题，也提示未来需要更加标准化的数据集、更强的模型以及融合更多生物学信息。

真核细胞通过细胞器、膜结构以及无膜凝聚体将不同生物学过程组织到特定空间中。线粒体负责能量代谢，溶酶体参与降解，细胞核调控基因表达，不同细胞区室共同维持细胞正常功能。蛋白质不仅构成这些细胞结构，也是几乎所有生命活动的执行者，因此明确蛋白质定位对于理解其功能具有重要意义。大量疾病与蛋白质错误定位密切相关，因此建立准确的亚细胞定位预测模型具有重要的基础研究和医学价值。

近年来，深度学习推动了序列预测方法的发展。从早期 DeepLoc 到 DeepLoc2、LAProtT5 等模型，研究重点逐渐转向利用蛋白质语言模型学习序列表示。然而，大多数方法仍存在明显不足：一方面，大部分模型仅预测十余个粗粒度细胞区室，难以区分核仁、核小体、核斑等更精细结构；另一方面，多数模型仍默认一个蛋白质只定位于一个区室，而真实情况下，大量蛋白质可同时分布于多个亚细胞区域。此外，已有模型通常使用规模有限的数据集进行评测，尚未形成统一、公认的大规模标准基准。

为此，研究人员重新整合多个权威数据库，建立统一的亚细胞标签体系，并系统评估当前所有主流序列预测方法，希望全面了解当前模型的真实能力和主要瓶颈。

方法

研究人员首先整合 UniProt、Human Protein Atlas 和 OpenCell 三个数据库的实验定位注释，建立统一的三级亚细胞定位标签体系，其中一级包含21个精细亚细胞区室。随后，根据至少两个数据库共同支持的定位信息，构建高可信度 HOU 测试集；其余蛋白用于构建训练集，并利用序列同源性过滤保证训练集与测试集之间不存在高相似序列。

随后，研究人员重新训练并评估 DeepLoc2、LAProtT5、MULocDeep 等代表性模型，同时系统比较 ProtT5、ESM2、ESM3 和 ProtBert 等蛋白质语言模型，以及平均池化、最大池化、Light Attention 和多头注意力等不同特征聚合策略。最后，还进一步分析模型注意力机制、生物学序列信号、蛋白互作网络以及致病突变对模型性能的影响。

图1｜统一亚细胞定位数据集与基准测试集构建流程。

结果

建立统一的大规模定位基准数据集

研究人员首先分析三个数据库之间的定位注释差异。结果发现，不同数据库不仅标签命名不同，对同一蛋白的定位粒度也存在明显差异。例如，HPA 更倾向于细分细胞骨架和细胞核内部结构，而 UniProt 对部分囊泡系统具有更详细的分类。与此同时，多定位蛋白在三个数据库中的比例也明显不同，其中 HPA 中超过60%的蛋白具有多个定位，而另外两个数据库仅约三分之一。

为了减少不同数据库之间的不一致性，研究人员建立统一标签体系，并筛选至少获得两个数据库共同支持的定位作为标准答案，最终构建出包含3,814个人类蛋白质的 HOU 测试集，成为目前规模最大、可信度最高的人类蛋白质亚细胞定位评测数据集。

现有定位预测模型系统评测

研究人员首先比较了目前主流定位预测模型。结果显示，随着定位标签由精细层级逐渐合并到粗粒度层级，所有模型性能均明显提高，说明当前模型更容易识别大的细胞器，而难以区分更细微的亚细胞结构。

在所有公开模型中，LAProtT5 表现最好，但其优势主要体现在常见定位类别，例如细胞质、线粒体、内质网和细胞核。对于核小体、核仁纤维中心、中间纤维等样本数量较少的类别，所有模型准确率均明显下降。

进一步分析发现，类别样本数量对预测性能影响很大。样本越丰富，模型表现越好；而对于罕见定位类别，即使最先进模型也很难学习到稳定特征。这说明目前模型仍高度依赖训练数据规模，而不是已经真正掌握蛋白质定位规律。

图2｜现有亚细胞定位预测模型综合评测。

蛋白质语言模型比较

除已有模型外，研究人员还系统比较了四种主流蛋白质语言模型及不同特征聚合策略。

结果显示，ProtT5 与多头注意力组合取得最佳总体性能，而 ESM2 配合平均池化也表现优异。相比之下，最大池化几乎始终表现最差，而平均池化这一简单方法却获得了稳定结果。

进一步观察各定位类别发现，各模型都能够较好预测细胞质、线粒体、内质网和细胞膜等主要细胞器，但对于中间纤维、核体、核仁纤维中心等精细定位仍然预测困难。例如，除 ESM3 外，其余模型几乎无法识别中间纤维定位蛋白。这说明模型性能瓶颈更多来自数据和任务本身，而非简单更换语言模型即可解决。

不同蛋白特征对预测性能的影响

研究人员进一步分析不同蛋白性质是否影响预测结果。结果显示，仅定位于一个细胞区室的蛋白更容易预测，而多定位蛋白预测明显更加困难。具有信号肽或转运肽的蛋白预测准确率明显提高，这说明模型能够学习到经典定位信号。

此外，膜蛋白整体预测效果优于非膜蛋白，而本征无序蛋白预测最困难。这可能与膜蛋白具有保守跨膜结构有关，而无序蛋白功能更加复杂，定位也更加动态。

图3｜不同蛋白性质对预测性能的影响。

模型关注了哪些序列信息

为了理解模型决策机制，研究人员分析 ProtT5-MHA 的注意力分布。结果发现，模型能够准确关注多数经典定位信号，例如信号肽、线粒体转运肽、跨膜结构域和核定位信号，约76%的已知定位信号能够被模型识别。

相比之下，普通功能结构域（如 PROSITE 数据库中的大量保守功能基序）与模型关注区域重叠较少，仅约22%。不过，研究人员也发现模型经常关注 DNA 结合结构域以及部分金属结合位点，这些区域虽然不是定位信号，但与核定位或囊泡系统具有一定生物学关联。

更有趣的是，模型还发现了一些此前尚未被注释的新序列模式，这些保守片段可能对应新的定位信号，为后续实验验证提供了候选区域。

图4｜模型注意力与蛋白定位信号分析。

蛋白互作网络和致病突变分析

研究人员进一步尝试引入蛋白质相互作用网络，希望利用相互作用蛋白往往共定位这一规律提升预测性能。

结果显示，引入 PPI 后总体性能提升十分有限，仅内质网、核斑等少数定位略有改善。这说明现有 PPI 网络仍然存在噪声较大、覆盖不足等问题，仅依赖图神经网络尚不足以显著改善定位预测。

随后，研究人员利用已知会导致蛋白错误定位的致病突变进行测试。结果发现，模型对于正常蛋白预测效果较好，但面对发生错误定位的致病突变时性能明显下降。308个突变中，仅11个突变能够使模型改变定位预测，说明当前模型几乎无法识别由单个氨基酸突变引起的定位变化。这意味着模型更多学习的是蛋白整体序列模式，而不是能够真正理解突变如何改变蛋白折叠、稳定性及运输过程。

图5｜蛋白互作网络与致病突变分析。

讨论

本研究建立了目前规模最大的人类蛋白质亚细胞定位综合基准，并首次系统评估了主流序列预测模型及蛋白质语言模型。结果表明，虽然当前模型已经能够较好预测常见细胞器定位，但在精细亚细胞结构、多定位蛋白以及致病突变导致的错误定位等更具挑战性的任务上仍存在明显不足。

研究人员认为，仅依赖蛋白质一级序列已经难以进一步突破预测性能。未来模型需要融合更多生物学信息，包括蛋白质三维结构、定位信号、蛋白质相互作用网络、RNA 定位信息以及生物分子凝聚体等动态细胞环境。同时，未来蛋白表示模型也应由单纯序列编码发展为能够联合学习序列、结构、相互作用和细胞状态的多模态基础模型。

此外，目前几乎所有定位模型都默认蛋白定位固定不变，而真实生物过程中，不同剪接异构体、不同细胞类型及不同细胞周期均可能产生不同定位模式。因此，未来亚细胞定位预测需要从静态分类逐步发展为能够描述蛋白质时空动态分布的新一代模型。

总体而言，这项工作不仅建立了新的标准基准，也揭示了当前蛋白质亚细胞定位预测领域仍存在的重要挑战，为未来更加精准、更加生物学一致的定位预测模型提供了发展方向。

整理 | DrugOne团队

参考资料

Wefers, Z., Gupta, A., Ahmed, N. et al. A comprehensive benchmark of sequence-based subcellular localization predictors for human proteins. Nat Methods (2026).

https://doi.org/10.1038/s41592-026-03142-6