摘要在细胞治疗从实验室研究逐步走向临床及产业化应用的过程中,诱导多能干细胞(iPSC)的规模化培养能力成为关键环节之一。 本文基于PBS Biotech公开资料,对PBS Mini体系中的二维种子培养方案、关键培养参数、材料选择及工艺优化策略进行整理,为建立稳定、可重复的iPSC培养工艺提供参考。 关键词:iPSC、诱导多能干细胞、iPSC培养、3D聚集体培养、垂直轮生物反应器、2D种子培养、PBS Mini、生物反应器、细胞治疗规模化、灌流培养在细胞治疗产品开发过程中,培养工艺不仅决定细胞产量, PBS Biolab团队针对多种商业化PSC培养体系进行了验证,结果显示,不同培养基和基质组合均可支持iPSC三维聚集培养及扩增过程。 关于技术来源:本文基于PBS垂直轮生物反应器、iPSC规模化培养、3D聚集体培养及细胞治疗工艺开发公开技术资料、参考文献曼博生物整理,用于科研技术交流分享和实验研究参考
研究者从正常人和HLHS患者来源的iPSC,诱导分化并富集CD144的EC细胞,进行单细胞测序,聚类分群(下图A、B、C)。 研究者将目光集中在二者的crosstalk上,iEEC和iPSC来源的心肌细胞共培养后对心肌细胞进行转录组测序(图AB)。 心肌细胞和不同来源的iEEC共培养后, 差异表达基因主要集中在细胞周期、心肌收缩、肌节形成(图B C)。 敲低FN1的心内膜细胞和心肌细胞共培养后,心肌细胞的增殖(图G,图H)、成熟(图I)、离子通道(图J)相关marker都有所下降。 研究者,体外增加FN1后,和HLHS 来源iEEC共培养的心肌细胞的功能有所恢复(图K-P)。
哈佛&MIT和斯坦福的研究表明,现在科学家可以使用 iPSC 在培养皿中对人脑建模。这不但扩大了研究范围,增强了研究获得的信息量,也减少了研究对患者的负担。 斯坦福 Pasca 等人则是让 iPSC 生成特定脑区的有机体(神经球),并把两个不同的神经球体融合在了一起。 首先看斯坦福的研究。 简单说,可以粗略理解为研究人员用 iPSC 诱导培养出两批不同的神经球,第一批跟精神分裂症有关(紫色),第二批则与焦虑、躁狂和癫痫有关(绿色)。 然后,研究人员将这两种不同类型的神经球放在一起。 正如上文所说,为了研究人类大脑的发育过程,科学家越来越多地转向有机体(神经球),也就是从 iPSC 培养的三维器官模型。 【注释】诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell,缩写 iPS 细胞或者 iPSC)为利用导入特定基因或是特定基因产物(蛋白质)等方式送入体细胞(比如皮肤细胞或是肝脏细胞
:发现 BAG956 通过促进 α-突触核蛋白聚集体的自噬清除逆转 PD 表型;光遗传学 iPSC 模型(带 optogenetic 工具)实现了对 α-突触核聚集动态过程的实时监测 • 抑郁症:iPSC 悬浮搅拌生物反应器提高可扩展性 缺乏组织微环境 单一细胞类型无法反映复杂体内环境 共培养系统、MPS 平台(见下节) 2.2 第二支柱:3D 类器官平台——组织层面的器官仿真 核心原理 类器官(Organoids )是将干细胞或患者来源组织在三维空间中进行自组织培养,形成具有器官级别结构与功能的多细胞体。 相比 2D 单层培养,类器官能够重现细胞间的空间关系、旁分泌信号、机械力传导以及组织级别的功能整合,是目前最接近真实人体组织的体外模型。 • 3D 生物打印:模拟血管扩散物理特性的支架支撑中脑类器官;多组分水凝胶共培养肿瘤-免疫模型评估肿瘤浸润淋巴细胞迁移和细胞毒功能 • 水凝胶微胶囊:具有仿生特性的水凝胶微胶囊实现可扩展的血管化肝脏类器官生成
iPSC 则提供了另一种可能。由于 iPSC 可以保留供体的遗传背景,并分化为心肌细胞、肝细胞、神经元、胰岛细胞等多种谱系,它特别适合遗传驱动疾病的建模。 文章提到,患者来源 iPSC 系统已用于 ALS、LMNA 相关血管病变、病毒易感性和纤维化等疾病相关研究,并支持药物发现或候选药物筛选。 但 iPSC 也不是完美模型。 类器官:让体外模型拥有组织结构 如果说二维细胞培养提供了细胞层面的可控系统,那么类器官则进一步引入了三维结构和细胞间相互作用。 这些例子说明,器官芯片并不只是更高级的细胞培养皿。它真正的价值在于把动态流动、组织屏障、力学刺激、免疫反应和多器官互作引入体外系统。 连续灌流和机械刺激可以缓解自由漂浮类器官常见的扩散限制和缺氧核心问题,并支持更长时间培养和实时监测。
iPSC 则提供了另一种可能。由于 iPSC 可以保留供体的遗传背景,并分化为心肌细胞、肝细胞、神经元、胰岛细胞等多种谱系,它特别适合遗传驱动疾病的建模。 文章提到,患者来源 iPSC 系统已用于 ALS、LMNA 相关血管病变、病毒易感性和纤维化等疾病相关研究,并支持药物发现或候选药物筛选。 但 iPSC 也不是完美模型。 类器官:让体外模型拥有组织结构 如果说二维细胞培养提供了细胞层面的可控系统,那么类器官则进一步引入了三维结构和细胞间相互作用。 这些例子说明,器官芯片并不只是更高级的细胞培养皿。它真正的价值在于把动态流动、组织屏障、力学刺激、免疫反应和多器官互作引入体外系统。 连续灌流和机械刺激可以缓解自由漂浮类器官常见的扩散限制和缺氧核心问题,并支持更长时间培养和实时监测。
培养基中的“魔法” 类器官可以由两种类型的细胞生成:1) 多能干细胞 (PSC),例如胚胎干细胞 (ESC) 和诱导多能干细胞 (iPSC);2) 器官限制性成体干细胞 (ASC)。 源自 ESC 和 iPSC 的类器官向所需的胚系进行定向分化,最终聚集产生浮动的球状体,随后被嵌入细胞外基质开始类器官培养(如图 5)。 将小肠组织切成几块(隐窝分离出来可做备选)。 2) 可操纵的培养系统实现定向分化:类器官通常在细胞外基质 (ECM) 中进行培养,ECM 周围是补充了类器官类型特定的生态位 (Niche) 因子的培养基。 类器官的培养离不开诱导细胞分化的细胞因子,MCE 提供各种类器官培养用细胞因子,高活性、高纯度、低内毒素! 体外实验中,BMP-2 和 BMP-4 被广泛应用于诱导多能干细胞 (iPSC) 和胚胎干细胞 (ESC) 产生肝细胞。
摘要:在人多能干细胞(hPSC)培养过程中,培养基质的选择会直接影响细胞扩增效率、培养稳定性以及长期培养成本。 关键词:LN521、Biolaminin521、全长Laminin、hPSC培养、人多能干细胞、iPSC培养、层粘连蛋白、干细胞培养基质、细胞扩增一、为什么hPSC培养越来越关注培养基质选择? 培养成本不仅涉及培养基消耗,同时还包括培养基质相关支出,因此需要进行综合评估。实验数据显示,在单次传代过程中,LN521体系的单位面积培养成本相较部分截短型层粘连蛋白以及其他培养基质体系表现较低。 实验分别选择HS181人胚胎干细胞以及iPSC3诱导多能干细胞进行比较分析。结果显示,在多个培养周期中,LN521培养体系均表现出较高的细胞扩增倍数以及更快的细胞生长速度。 数据图5.不同培养体系下单位细胞培养成本比较进一步分析可以发现,LN521培养体系中的培养基与基质成本分配更加均衡,同时无需通过增加培养基使用量来获得更高细胞产量,因此在长期培养项目中能够降低整体资源消耗
它涉及到如何培养一些正确的做事态度来建立信任,鼓励交流与协作,最终让人们更加适应,并产生高效。 敏捷方法常常被描述为以人为中心,而不是强调技术,并有充分的理由来说明这一点。 在培养敏捷团队中的最后一个潜在因素就是需要一点谦虚的品德。在敏捷团队中,谦虚有很多好处。其一就是它减少那种反生产力的“得分式(point scoring)”竞争的可能性。 结论 在敏捷团队中培养高效的态度和工作方式是一个复杂而关键的活动。很多试图进行敏捷项目的人把焦点放在业务上。尽管业务很重要,但是一定要记住:项目干系人 都是人。他们也有他们的个人需求和关心的事情。 敏捷不是被“统治”出来的,但 是,假如给予那些具有能动性的团队成员进行自我组织的自由,那么敏捷是能培养出来的。 关于作者 Dafydd 是专注于敏捷方法和面向对象开发的软件开发人员。
iPSc 诱导多功能干细胞具有两个特点一个是自我更新,一个是多潜能分化,如果想证明一个基因到底在哪个过程起作用,需要一下模型,方法来自于,这里面会分享一些Brumbaugh et al., 2018, 末端分化模型 pre-B cell to macrophages MEFs into TAU1-GFP+ induce neuros(iNs) 以上模型用来研究某个基因是否影响通过干细胞分化能力来调控iPSc
为此,作者开发了一种机器学习方法来寻找药物小分子,以广泛纠正在人类诱发的多能干细胞(iPSC)疾病模型中失调的基因网络,该疾病模型涉及主动脉瓣的常见心脏病。 通过人类iPSC技术,网络分析和机器学习技术,这种方法可能代表药物发现的有效途径。 1 介绍 确定驱动人类疾病的基因调控网络,可以设计出针对核心疾病机制的疗法。 疾病生物学通常是特定于细胞类型的,因此利用人类诱导的多能干细胞(iPSC)和基因编辑技术可以直接筛选文库,以评估人类疾病相关细胞中的基因网络校正。 在这项工作中,作者进行了基于网络的药物筛选以识别小分子,这些小分子纠正了来自患有AV狭窄和CAVD的患者在iPSC衍生的EC中,由N1单倍剂量不足引起的基因网络失调。 此外,验证分子XCT790恢复了非家族性CAVD患者瓣膜培养的原发性EC中关键失调节点,从而验证了iPSC衍生的EC模型的使用并证明了研究结果可扩展至散发病例。
产品界,有一个特别虚幻的名词:“产品感”,这个词经常被人挂在嘴边(呵呵哒,也包括我)。 比如: 面试结束后,HR问你,这个小朋友怎么样啊? 你回答:产品感不好。 这个时候HR也就不再追问了。 这种对话,特别像见丈母娘,你表现再好,丈母娘一句话“不靠谱”就给定性了。 产品感是不是真实存在的东西呢?在我看来,是存在的。比如射箭,韩国的林东贤,高度近视,但不妨碍他拿一堆的金牌,靠的就是一种内在的感觉。 Q:请你推荐几款比较有意思的产品? A:微信、微博、人人。 Q:有哪些产品的交互你觉得特别好? A:微信的红包
首先,Activin A是多能干细胞(包括 ESC和iPSC)分化为内胚层的核心因子。 在iPSC向内胚层分化的培养体系中,添加高浓度的重组 Activin A(100-200 ng/mL)并联合LY294002(AbMole,M1925)抑制 PI3K 通路,可上调内胚层特异性标志物(如 例如,在肠道类器官培养中,以内胚层来源的肠祖细胞为种子细胞,添加重组 Activin A(100 ng/mL)可维持肠祖细胞的增殖能力,同时促进肠上皮细胞的分化与隐窝-绒毛结构的形成;而在肝脏类器官的培养中 其中重组Activin A在肌肉类器官的培养中可协同 MyoD(肌分化因子)促进肌卫星细胞的增殖与分化,并加速肌纤维的形成,同时维持肌肉类器官的收缩功能[10];在肾脏类器官的培养中,重组Activin Activin A用于类器官的培养[11]3.
也可用于某些细胞的定向分化诱导,例如10 μg/ml的Insulin 、1 μM Dexamethasone 、0.5 mM IBMX(PDE抑制剂)和5 μM Rosiglitazone 组成的分化培养基可以诱导前体脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞 由AbMole提供的Insulin(Human,AbMole,M9194)在上述实验中,作为培养基中重要的组成成分之一,维持乳腺相关细胞的存活、增殖和正常功能。 在3D 培养体系中Insulin(10 μg/ml)还用于诱导 iPSC-MCs 形成乳腺样类器官,保障类器官结构形成与功能稳定[8]。图 2. Chen, et al., Human iPSC-based breast cancer model identifies S100P-dependent cancer stemness induced
iPSC 成为潜在的替代方案,但重编程过程潜在致瘤性使 iPSC 尚未被接受为理想的干细胞来源。新的趋势是用小分子直接将容易获得的细胞类型重编程为临床有用的细胞 (如神经元和心脏细胞)[151]。 CHIR99021 导致 DNA 低甲基化维持培养中小鼠 ECS 的多能性; (3) 调控蛋白质激酶 A 家族 (PKA) 的信号通路:PKA 调节胚胎干细胞的多能性,本身受第二信使分子环腺苷酸 (cAMP CHIR99021 与 Oct4 和 Klf4 联用即可诱导小鼠胚胎成纤维细胞重编程为 iPSC。 Y27632 是干细胞研究中最常用的 ROCK 抑制剂,可以阻止细胞凋亡,已被用于建立悬浮培养和人类 iPSC 的长期扩增。 槲皮素也可阻止移植的 iPSC 的肿瘤发生。
传统二维细胞培养模型在以下方面存在局限:难以模拟体内动态微环境细胞功能维持时间有限对复杂毒性机制响应不足因此,能够更好模拟体内环境的体外模型逐渐受到关注。 二、研究设计:不同模型的系统对比在一项针对肝脏模型的系统性研究中,对以下模型进行了对比评估:肝脏微生理系统(MPS)模型不同结构的器官芯片模型传统二维静态培养模型实验选用三类常见细胞来源:原代人肝细胞( PHH)HepaRG细胞iPSC衍生肝细胞并围绕以下关键指标进行分析:胆汁酸代谢转运体表达(如BSEP、MRP2/3)核受体信号通路(如FXR、PXR)代谢功能(CYP活性)细胞功能指标(白蛋白、尿素) 三、微生理系统的结构特点典型肝脏微生理系统通常具备以下结构特征:多腔室结构设计连续流动培养体系可调控流速这种结构能够:提供稳定的营养与氧气分布降低局部应激更接近体内肝脏微环境四、关键实验结果分析1长期功能维持能力在约 30天培养周期内:白蛋白分泌保持稳定尿素生成持续CYP酶活性维持较高水平说明:动态培养体系有助于维持肝细胞功能2胆汁酸相关响应能力在胆汁淤积诱导条件下:部分模型可检测到胆汁酸分泌变化这一指标与胆汁淤积机制密切相关说明
但是体细胞重编程的效率不高,只有一小部分细胞成 为 iPSC。这导致获取 iPSC 需要极高的成本。 使用单细胞技术对 iPSC 进行研究,有助于追踪干细胞分 化和发育的过程,提高重编程效率,降低 iPSC 的应用成本。 对不同阶段小鼠 iPSC 细胞进行 scRNA-seq[Buganim, Y et al. Cell Rep. 2019] ,可确定血管内祖 细胞和分化细胞之间的层次关系;对正在分化中的 iPSC 进行 scRNA-seq [Cuomo ASE et al. 有研究通过对人诱导多能干细胞(iPSC)的 单细胞测序([Liao M. C et al. J.
研究人员对315000个单细胞(在小鼠成纤维细胞重编程为iPSC的过程中,每隔6~12小时收集一次样品,共持续了18天)进行大规模RNA测序并解析了测序结果。 利用Waddington-OT将不同时间点的细胞类型和细胞分布进行关联,成功追溯了从成纤维细胞到iPSC重编程过程中细胞变化的轨迹,绘制了从小鼠胚胎成纤维细胞到iPSC重编程的“细胞地图”。 最后,研究人员通过Waddington-OT预测,发现转录因子Obox6和细胞因子GDF9都能够增强产生iPSC的效率。 ? 在表达胚胎间叶组织和长期培养的MEF信号时(图S2A), SR不能简单地反映MEF逆转(图S2B)。特别是,新生儿肌肉和新生儿皮肤的特征在SR中丰富了20- 30倍。 这些iPSC的祖细胞还没有完全获得多能性的特征,但正在迅速地朝着这个轨迹改变。 ? 作者的研究表明:1%的iPSCs在2i和血清条件下都显示出2C特征。 ?
然而,山中因子也存在一个重大局限:重编程效率极低,它需要数周时间,而且在实验室培养皿中,只有不到 1% 的细胞能够完成再生之旅。 这些细胞来自三位年龄超过 50 岁的中年人类捐赠者) 结果发现,仅仅 7 天内,超过 30% 的细胞开始表达关键多能性标志物(SSEA4 和 TRA-1-60),等到第 12 天时,出现了大量形态与典型诱导性多能干细胞(iPSC 随后,研究者验证了这些 RetroFactor 衍生的 iPSC 能够成功分化为所有三个原始胚层 —— 内胚层、外胚层和中胚层。 此外,他们扩增了多个单克隆 iPSC 细胞系,并进行了多次传代,证实了其具有健康的核型(如图 7 的右侧所示),且基因组稳定性适合细胞治疗。 这些结果进一步佐证了工程化变体的稳健性,还为跨不同递送方式和细胞类型增强 iPSC 生成能力提供了实证依据。
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