**摘要：**在CAR-T、TCR-T等工程化T细胞研究中，转导效率受到细胞来源、激活状态、载体用量、转导方式和培养条件等多个变量影响。对于脐带血来源CD8+ T细胞，单纯提高感染复数（MOI）并不一定是最合理的优化方式。2021年发表于《Molecular Therapy: Methods & Clinical Development》的一项研究，对脐带血CD8+ T细胞的LV载体转导流程进行了系统比较。在MOI为10的条件下，采用过夜孵育代替离心转导，并调整转导培养基后，PGK和MND启动子对应的GFP阳性比例分别达到78%±7.7%和83%±8.8%。本文围绕转导方式、培养基、启动子表达强度和细胞来源展开分析，说明为什么转导阳性率、载体拷贝数和转基因表达强度需要分开评价，以及如何利用这些数据理解工程化T细胞转导工艺中的不同影响因素。

**关键词：脐带血CD8+T细胞、T细胞转导、LV载体转导、转导效率、MOI、过夜孵育、离心转导、StemMACS、X-Vivo15、MND启动子、PGK启动子、载体拷贝数、VCN**

---

## 一、为什么提高MOI不应该成为T细胞转导优化的唯一思路

在CAR-T、TCR-T等工程化T细胞研究中，外源基因递送是建立目标细胞功能的重要环节。基于lentiviral vector（LV）的基因递送体系可以用于T细胞工程化，但实际转导效率并不只取决于投入了多少载体颗粒，还受到细胞激活状态、培养环境、载体构建以及转导过程本身的影响。

当转导阳性率偏低时，提高感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）是一种常见思路。MOI反映的是实验设计中的载体投入水平，而不是每个细胞最终实际获得的整合拷贝数。提高MOI可能增加细胞接触和获得递送载体的机会，但同时也会增加载体物料消耗，并可能改变最终细胞中的载体拷贝数（Vector Copy Number，VCN）。

对于需要进一步评价基因整合安全性和细胞质量的工程化T细胞产品，转导效率与VCN不能被视为同一个指标。较高的GFP阳性比例并不自动意味着最终细胞质量更好，而较高的载体投入也不能保证所有细胞都获得均一表达。

脐带血来源CD8+ T细胞还具有自身特点。与成人外周血T细胞相比，脐带血T细胞通常具有较高比例的低分化细胞群体，因此研究者除了希望获得有效转导，还希望尽量保留相关细胞状态。

荷兰乌得勒支大学医学中心（UMC Utrecht）团队2021年发表的研究围绕这一问题开展了系统比较，分别分析转导方式、培养基、启动子和细胞来源对最终结果的影响。在相应优化条件下，研究获得了约83%的GFP阳性细胞比例，为理解不同工艺变量的作用提供了具体数据。

## 二、过夜孵育与离心转导为什么会得到不同结果

转导方式是这项研究最先比较的变量之一。

研究人员使用激活后第3天的脐带血CD8+ T细胞，在MOI为10的条件下比较两种不同转导方式：一种是离心转导（spinoculation），另一种是较长时间的过夜孵育。

离心转导条件为在室温下与LV载体混合后，于32℃、800×g条件下离心30分钟；过夜孵育组则采用14~16小时的孵育方式。研究在转导后第6天检测GFP阳性细胞比例，并同时比较PGK和MND两种启动子。

在X-Vivo15培养基条件下，离心转导组PGK启动子对应的GFP阳性率为24%±5%，MND启动子为31%±9%；改为过夜孵育后，PGK组提高至48%±11%，MND组达到68%±8%。

这说明，在该研究的脐带血CD8+ T细胞体系中，过夜孵育获得了高于对应离心转导组的GFP阳性比例。尤其对于MND启动子构建，两种转导方式之间的数值差异较为明显。

但需要注意，这并不意味着离心转导在所有T细胞体系中都不适用。离心转导与过夜孵育不仅操作方式不同，细胞与载体接触的时间条件也不同，因此最终结果仍然受到具体细胞、培养基和载体构建等因素影响。

这项研究更直接的结论是：**对于所研究的脐带血CD8+ T细胞，转导接触方式本身就是值得优化的变量，不能只围绕MOI进行调整。**

## 三、为什么仅更换转导培养基，GFP阳性比例还能继续提高

完成转导方式比较后，研究团队进一步分析了转导期间培养基的影响。

在保留过夜孵育方式的基础上，将转导培养基由X-Vivo15调整为StemMACS HSC Expansion Medium XF后，研究观察到更高的GFP阳性细胞比例。

其中，PGK启动子对应的GFP阳性率达到78%±7.7%，MND启动子则达到83%±8.8%。

| 转导方式 | 转导培养基 | PGK启动子 | MND启动子 |
| :---: | :---: | :---: | :---: |
| 离心转导 | X-Vivo15 | 24%±5% | 31%±9% |
| 过夜孵育 | X-Vivo15 | 48%±11% | 68%±8% |
| 过夜孵育 | StemMACS | 78%±7.7% | 83%±8.8% |

**表1：不同转导方式与培养基条件下的GFP阳性细胞比例（MOI=10）**

这组数据包含两个值得区分的比较。

首先，在相同X-Vivo15培养基和MOI条件下，转导方式从离心转导变为过夜孵育后，PGK和MND对应的阳性比例均有所提高。

其次，在均采用过夜孵育的条件下，由X-Vivo15切换至StemMACS后，两个启动子对应的GFP阳性比例进一步提高。

因此，这项研究中约83%的转导结果并不是通过单独提高载体用量获得，而是在固定MOI的前提下，结合转导方式和培养环境优化后观察到的结果。

这也提示，转导培养基并不只是为细胞提供基础营养的背景条件。对于不同细胞及递送体系，培养基组成可能影响细胞状态以及最终测得的转导结果。

不过，研究数据只能直接证明所比较的培养基条件存在结果差异，并不能据此确定是哪一种具体培养基成分造成了全部变化。若要进一步解释分子机制，仍需要额外研究。

## 四、PGK与MND启动子为什么需要同时比较阳性率和表达强度

在转导研究中，经常使用GFP阳性细胞比例评价基因递送结果，但这一指标并不能完整描述表达水平。

例如，两种启动子构建可能得到相近的GFP阳性比例，但阳性细胞内部的GFP表达强度仍然可能存在较大差异。

该研究进一步比较了PGK和MND两种启动子。原始资料显示，两者在作者所关注的GFP阳性率比较中没有呈现一致的显著差异，但MND驱动的GFP表达强度更高，其GFP阳性细胞中位荧光强度（MFI）约为PGK的3倍。

研究人员还将荧光表达强度按照载体拷贝数（VCN）进行归一化，发现两种启动子之间的表达差异仍然存在。

![脐带血CD8+T细胞LV转导方案优化及PGK与MND启动子比较](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/a3f436cbff25e28f783d59e23011b039.jpg)

**图1：脐带血CD8+ T细胞转导方案优化。（A）离心转导与过夜孵育的GFP阳性率；（B）X-Vivo15与StemMACS培养基比较；（C）代表性流式结果；（D、E）MND与PGK启动子的GFP表达强度及VCN归一化分析[1]。**

这一结果非常适合说明三个指标之间的区别。

**GFP阳性率**反映达到检测阈值的细胞比例；**MFI**反映相应阳性细胞群体的荧光表达水平；**VCN**则用于描述所测样本中整合载体序列的拷贝情况。

如果不同构建具有相近的GFP阳性率，但表达强度差异明显，就不能简单认为它们在所有方面具有相同的转导表现。

同样，当MFI提高时，也需要判断这种变化是否与VCN增加有关。研究采用VCN归一化分析，正是为了进一步区分表达差异和载体拷贝水平之间的关系。

但MND启动子在GFP报告实验中获得较高MFI，并不意味着它对于所有CAR或TCR构建都一定具有相同幅度的表达优势。目标基因、载体设计和细胞体系仍可能改变最终结果。

## 五、为什么脐带血CD8+ T细胞与外周血CD8+ T细胞的转导表现不同

除转导方式、培养基和启动子以外，研究还比较了不同来源T细胞的表现。

原始资料指出，在所采用的优化转导体系中，脐带血CD8+ T细胞表现出高于外周血CD8+ T细胞的转导效率。

这一现象需要结合两类细胞的初始组成理解。新鲜分离的脐带血CD8+ T细胞具有较为均一的naïve相关表型，典型标志物组合包括CD45RO−CD62L+CD45RA+；外周血CD8+ T细胞则通常由不同分化阶段的细胞组成，其中包含多个记忆T细胞亚群。

因此，即使采用相同的载体和转导条件，不同细胞群体对激活、培养环境及基因递送的响应也不一定相同。

研究还观察到，脐带血CD8+ T细胞经过扩增和转导后，部分naïve相关标志物重新呈现相应变化，包括CD45RO下调和CD45RA上调，而外周血T细胞没有出现同样的变化趋势。

与此同时，TIM3、LAG3等共抑制受体在研究所检测的脐带血T细胞中保持相对较低的表达水平。

这些数据提示，细胞来源不仅可能影响转导效率，还可能影响培养后的细胞表型。不过，不能仅依据CD45RA、CD45RO或者某一共抑制受体的变化，就认定细胞已经完全恢复到功能意义上的初始T细胞状态。相应表型仍需要结合其他指标和功能实验解释。

## 六、为什么脐带血T细胞工艺不能只把83%当作优化目标

在研究所采用的特定条件下，MND启动子构建获得83%±8.8%的GFP阳性比例，是一个具有参考价值的数据。但如果将这一结果直接作为其他细胞来源、其他载体或者其他CAR构建的统一目标，就容易忽略研究条件之间的区别。

这项研究使用的是激活后第3天的脐带血CD8+ T细胞，在MOI为10的条件下进行转导方式、培养基和启动子比较。改变其中任何一个变量，都可能影响最终结果。

而且，较高的GFP阳性率本身也不能替代载体拷贝数、细胞活率、扩增情况和细胞表型评价。对于工程化T细胞制造，真正需要的是能够兼顾有效转导和目标细胞质量的完整工艺，而不是单纯追求报告基因阳性率最大化。

因此，阅读和引用类似研究时，至少应同时记录以下四类信息：

1. **细胞条件：**包括细胞来源、CD8+细胞群体、激活时间和初始分化状态。
2. **载体与转导条件：**包括MOI、转导方式、培养基及所用启动子。
3. **转导相关指标：**包括GFP阳性率、表达强度和VCN，并区分各自的检测含义。
4. **培养后细胞状态：**包括活率、扩增情况以及CD45RA、CD45RO、TIM3和LAG3等研究所关注的表型。

只有把这些条件与结果联系起来，才能比较清楚地判断转导效率的变化来自哪里，以及某一优化方案是否真正适合后续工程化T细胞研究。

## 七、如果需要降低载体投入，为什么应该先区分基础工艺优化与增强剂效应

对于需要降低LV载体物料消耗的项目，转导增强剂是一类可以进一步研究的工具。但这项研究的一个重要启示，是在引入额外增强材料之前，基础转导流程本身就存在明显的优化空间。

研究人员通过比较过夜孵育、离心转导、X-Vivo15和StemMACS等条件，在MOI保持为10的情况下，观察到GFP阳性细胞比例发生明显变化。

因此，判断某种增强剂的实际贡献时，必须先确认对照组使用的是哪一套基础转导条件。如果对照组本身采用尚未优化的培养方式，那么最终改善可能同时来自基础流程变化和增强材料，难以区分各自的影响。

在同一项研究中，团队在基础工艺比较之后才进一步评价LentiBOOST等增强条件。这种研究安排有助于把不同变量的影响分开分析。

因此，基础工艺优化和增强剂评价应被视为两个相互关联但需要分别解释的研究层级。

---

## 八、总结

脐带血CD8+ T细胞的LV载体转导效率，并不是一个只由MOI决定的结果。2021年UMC Utrecht团队的研究显示，转导方式、培养基、启动子以及细胞来源都可能影响最终GFP阳性比例和表达强度。

在MOI为10的条件下，离心转导组的PGK和MND启动子对应GFP阳性率分别为24%±5%和31%±9%；改为过夜孵育后，两者分别达到48%±11%和68%±8%。继续将过夜转导培养基调整为StemMACS后，PGK和MND组进一步达到78%±7.7%和83%±8.8%。

与此同时，启动子比较还提示，转导阳性率和表达强度并不等价。MND启动子驱动的GFP表达强度约为PGK的3倍，在按照VCN归一化后仍然存在差异。

在细胞来源方面，脐带血CD8+ T细胞与外周血CD8+ T细胞表现出不同的转导和表型特征，说明细胞起始状态同样是重要变量。

因此，这项研究提供的主要技术经验并不是所有脐带血T细胞都能达到83%的转导率，而是需要将以下因素共同纳入分析：

**细胞来源与激活状态 → 转导方式 → 培养基环境 → 启动子表达 → GFP阳性率、MFI与VCN → 培养后细胞表型。**

对于CAR-T、TCR-T等工程化T细胞研究，建立能够稳定解释这些变量之间关系的工艺，比单纯增加载体投入更具有参考意义。

## 参考文献

[1] Lo Presti V, Cornel AM, Plantinga M, Dünnebach E, Kuball J, Boelens JJ, Nierkens S, van Til NP. Efficient lentiviral transduction method to gene modify cord blood CD8+ T cells for cancer therapy applications. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 2021;21:357–368. DOI: 10.1016/j.omtm.2021.03.015.

> 本文基于Lo Presti等2021年发表的研究及相关公开技术资料整理，用于脐带血CD8+ T细胞、LV载体转导、培养基比较、启动子表达及工程化T细胞工艺研究等方向的科研信息分享。文中MOI=10、32℃/800×g/30分钟、14~16小时过夜孵育、GFP阳性率以及MFI与VCN等数据均对应原研究的特定细胞和实验条件，不能直接作为其他细胞来源或载体构建的通用工艺标准。

摘要：在CAR-T、TCR-T等工程化T细胞研究中，转导效率受到细胞来源、激活状态、载体用量、转导方式和培养条件等多个变量影响。对于脐带血来源CD8+ T细胞，单纯提高感染复数（MOI）并不一定是最合理的优化方式。2021年发表于《Molecular Therapy: Methods & Clinical Development》的一项研究，对脐带血CD8+ T细胞的LV载体转导流程进行了系统比较。在MOI为10的条件下，采用过夜孵育代替离心转导，并调整转导培养基后，PGK和MND启动子对应的GFP阳性比例分别达到78%±7.7%和83%±8.8%。本文围绕转导方式、培养基、启动子表达强度和细胞来源展开分析，说明为什么转导阳性率、载体拷贝数和转基因表达强度需要分开评价，以及如何利用这些数据理解工程化T细胞转导工艺中的不同影响因素。

脐带血CD8+ T细胞转导效率怎么优化？过夜孵育、培养基与启动子实验数据解析

在CAR-T、TCR-T等工程化T细胞研究中，转导效率受到细胞来源、激活状态、载体用量、转导方式和培养条件等多个变量影响。对于脐带血来源CD8+ T细胞，单纯提高感染复数（MOI）并不一定是最合理的优化方式。2021年发表于《Molecular Therapy: Methods & Clinical Development》的一项研究，对脐带血CD8+ T细胞的LV载体转导流程进行了系统比较……

应用科学家

其他

2021年发表于Molecular Therapy的研究系统优化了脐带血CD8+T细胞慢病毒转导工艺，在MOI为10时，采用过夜孵育结合StemMACS培养基，使PGK和MND启动子的GFP阳性率分别达78%和83%。研究揭示转导阳性率、表达强度与载体拷贝数需独立评价，MND表达强度约为PGK的3倍，且脐带血T细胞转导效率优于外周血，为工程化T细胞制造提供了非依赖高MOI的优化策略。

2026上云采购 | AI焕新·智启新局

tmmca

文章

问答

视频

教程

学习中心

腾讯云实验室

直播

竞赛

腾讯云代码分析专区

腾讯iOA零信任安全管理系统专区

腾讯云架构师技术同盟交流圈

腾讯云数据库专区

腾讯云智能顾问专区

腾讯云原生专区

腾讯混元专区

腾讯云TCE专区

腾讯云Lighthouse专区

腾讯云HAI专区

腾讯云Edgeone专区

腾讯云存储专区

腾讯云智能专区

腾讯轻联专区 

腾讯云开发专区

TAPD专区

腾讯轻量云游戏服专区

EdgeOne AI 安全实战专区

腾讯云最具价值专家

腾讯云架构师技术同盟

腾讯云创作之星

腾讯云开发者先锋

腾讯云代码助手

云原生构建

TAPD 敏捷项目管理

Cloud Studio

SDK中心

API中心

命令行工具

涵盖代码开发、场景应用、自动测试全流程，助你从零构建专属AI助手

一站式MCP教程库，解锁AI应用新玩法

聚焦“写作效率、视觉美观与运行性能”三方面进行全面升级，为您提供更高效、稳定的创作环境

社区富文本&Markdown编辑器全新改版上线，欢迎大家体验!

诚挚邀请您参与本次调研，分享您的真实使用感受与建议。您的反馈至关重要，感谢您的支持与参与！

社区新版编辑器体验调研

2021年发表于Molecular Therapy的研究系统优化了脐带血CD8+T细胞慢病毒转导工艺，在MOI为10时，采用过夜孵育结合StemMACS培养基，使PGK和MND启动子的GFP阳性率分别达78%和83%。研究揭示转导阳性率、表达强度与载体拷贝数需独立评价，MND表达强度约为PGK的3倍，且脐带血T细胞转导...

脐带血CD8+ T细胞转导效率怎么优化？过夜孵育、培养基与启动子实验数据解析-腾讯云开发者社区-腾讯云

脐带血CD8+ T细胞转导效率怎么优化？过夜孵育、培养基与启动子实验数据解析

脐带血CD8+ T细胞转导效率怎么优化？过夜孵育、培养基与启动子实验数据解析

社区

活动

圈层

关于

腾讯云开发者

热门产品

热门推荐

更多推荐