Xenium / CosMx 目标细胞邻域分析：关键注意事项

作者，Evil Genius

挨打倒计时，欢迎各位旁观。

今天我们汇总一个知识点，Xenium / CosMx 目标细胞邻域分析：关键注意事项。

对于 Xenium 和 CosMx 这类单细胞分辨率空间转录组平台，如果想研究某一类目标细胞（例如肿瘤细胞、Treg、巨噬细胞或中性粒细胞）周围的微环境，最重要的是：先定义目标细胞，再明确邻域的定义方式，最后区分空间关联与真正的生物学机制。

一、首先明确：研究的是哪一种“邻域”？

1. 固定目标细胞，分析其周围的细胞组成

例如，选择所有 Treg，统计每个 Treg 周围一定距离内的肿瘤细胞、巨噬细胞、CD8 T 细胞等。

回答：目标细胞通常处于什么样的微环境？不同组的邻居组成是否不同？

2. 根据邻居的细胞类型组合，对目标细胞分亚群

例如，将 Treg 划分为肿瘤细胞富集邻域型、髓系细胞富集邻域型和淋巴细胞富集邻域型。

回答：目标细胞是否处于不同的空间生态位？这些生态位在疾病组之间如何变化？

3. 研究邻域与目标细胞转录状态的关系

比较不同邻域中的目标细胞差异基因、通路和配体–受体信号。

回答：不同空间环境是否与目标细胞的激活、抑制或分化状态相关？

这三种分析并不互斥。通常建议先完成第一种，再开展第二种和第三种。

二、最重要的 8 个注意事项

1. 目标细胞必须先准确注释

不能仅根据空间位置或少数几个 marker 就判定目标细胞类型。

• 结合基因表达、经典 marker、细胞分群结果进行注释。
• 对相似细胞类型进行区分，例如单核细胞与巨噬细胞、Treg 与其他 CD4 T 细胞。
• 对低质量细胞、疑似双细胞和不确定注释的细胞单独检查。

尤其需要注意：邻近肿瘤细胞的免疫细胞可能出现肿瘤相关转录本信号，因此不能把邻居的表达直接当成目标细胞自身的表达。Xenium 的技术评估研究已指出，细胞分割和邻近转录本污染可能影响细胞类型判定。

2. 邻域距离不要随意设定

这是最容易影响结论的步骤之一。

建议：优先采用多尺度分析，而不是只选一个距离。

例如，可先测试 10、20、30 μm 三个尺度，再根据细胞大小、组织结构和研究问题确定主要分析尺度。这些数值只是可测试的起点，并非 Xenium 或 CosMx 的通用标准。

如果研究的是细胞直接接触、免疫突触或细胞膜接触，单纯的质心距离还不够，最好结合细胞边界或细胞间最短距离。

3. Xenium 与 CosMx 不能完全照搬同一套空间参数

Xenium

重点检查细胞分割、细胞边界、转录本分配，以及细胞扩张参数是否影响细胞类型和邻域组成。Xenium 不同分析版本及染色方案可能采用不同的分割策略。

CosMx

重点检查 FOV（视野）边界、细胞分割质量、跨视野拼接情况，以及视野之间的细胞密度差异。CosMx 的分割与空间数据处理需要考虑 FOV 特性，不能直接将各视野边界当作真实的组织边界。

如果两个平台的数据需要联合分析，应尽量统一细胞类型定义、邻域计算逻辑、距离单位和统计口径，同时保留平台信息用于质量评估与敏感性分析。

4. 不要把邻居数量和邻居比例混为一谈

例如，同样是一个 Treg 周围 20 μm 范围：

• 样本 A：周围有 10 个细胞，其中 5 个是巨噬细胞。
• 样本 B：周围有 30 个细胞，其中 9 个是巨噬细胞。

巨噬细胞的绝对数量在 B 中更高，但占比在 A 中更高。

因此，建议同时统计：

• 邻居细胞总数：反映局部细胞密度。
• 各类邻居的数量：反映局部细胞丰度。
• 各类邻居的比例：反映邻域组成。
• 目标细胞到特定细胞类型的距离：反映空间接近程度。

否则，很容易把组织整体细胞密度的变化误判为特定细胞的空间招募。

5. 目标细胞邻域分析与全组织空间分区不是一回事

如果研究目标是 Treg 的邻域，建议以 Treg 为中心构建邻域，而不是直接对全组织进行空间聚类后，将空间区域当作 Treg 的亚群。

两种方法回答的问题不同：

• 全组织空间分区： 组织有哪些空间区域或生态位？
• 目标细胞邻域分群： 同一种目标细胞处于哪些不同的局部细胞组合中？

如果目标是研究 Treg 的不同微环境，第二种更贴合研究问题。也可以将全组织空间分区作为辅助分析，验证目标细胞邻域是否富集于特定组织区域。

6. 邻域亚群不能只靠聚类结果命名

假设将目标细胞分成 C0、C1、C2、C3 四个邻域亚群，不能直接根据 UMAP 形状命名。

应检查每个亚群的邻居细胞组成，再依据实际富集的细胞类型命名，例如：

• Macrophage-enriched neighborhood
• T-cell-enriched neighborhood
• Tumor-associated neighborhood
• Lymphocyte-rich neighborhood

这些只是命名示例，最终名称应由真实数据决定。

还要区分两个概念：

• 目标细胞的邻域亚群：根据邻居组成或空间结构划分。
• 目标细胞的转录状态亚群：根据目标细胞自身的基因表达划分。

两者可能相关，但不能互相替代。建议将邻域亚群与目标细胞自身的差异基因、通路富集结果进行关联分析。

7. 统计分析必须以生物学样本为单位

这是决定结果是否可靠的关键。

如果一个样本包含数千个目标细胞，这些细胞并不等于数千个独立生物学重复。直接把每个细胞当作独立样本进行组间检验，容易产生伪重复和过于显著的 P 值。

推荐流程：

1. 在每个样本内计算目标细胞的邻域组成。
2. 按样本汇总各邻域亚群的比例、数量或特征。
3. 以患者或独立生物学样本为统计单位开展组间比较。
4. 如果同一患者有多个组织区域、多个切片或多个视野，使用合适的配对或分层统计模型。

如果不同组的样本数量、组织面积或目标细胞数量差异很大，还应考虑抽样平衡、组成型数据特征和统计效能。

8. 邻域关联不能直接等同于细胞互作机制

例如，发现 Treg 周围巨噬细胞富集，只能说明二者在空间上存在关联，不能直接证明巨噬细胞招募了 Treg。

建议分三步验证：

1. 空间关联： 证明两类细胞的邻近程度或邻域组成具有统计学差异。
2. 分子关联： 分析邻域中目标细胞的差异基因、通路，以及合理的配体–受体候选信号。
3. 独立验证： 通过蛋白染色、其他空间数据集或独立队列验证关键发现。

如果只使用 Xenium 或 CosMx 转录数据，论文中应使用“associated with”“spatially enriched”或“potential interaction”等措辞，避免将计算推断直接描述为已证实的因果机制。

三、推荐的完整分析流程

Step 1. 数据质控

转录本质量、细胞分割、细胞类型注释、FOV / 组织边界

Step 2. 筛选目标细胞

例如 Treg、巨噬细胞或肿瘤细胞

Step 3. 构建空间邻域

固定半径、最近邻或多尺度邻域

Step 4. 邻域组成分析与分群

细胞数量、比例、邻域聚类、生态位注释

Step 5. 组间比较

邻域比例、空间距离、不同样本中的复现性

Step 6. 机制探索与验证

目标细胞差异基因、通路、配体–受体与独立验证

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