文献分享（visium HD）--转座元件与同型生态位驱动黑色素瘤表观遗传免疫治疗中的免疫动态与耐药

作者，Evil Genius

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摘要

黑色素瘤的可塑性通过动态细胞状态转换驱动免疫逃逸和治疗耐药，这些转换超越遗传改变。尽管表观遗传重塑是这一过程的核心，但其在治疗压力下的影响尚不清楚。研究团队利用单细胞多组学和空间转录组学，对参加1b期NIBIT-M4表观免疫治疗试验（NCT02608437，DNA甲基转移酶1抑制剂联合抗CTLA-4）的黑色素瘤患者进行了纵向活检分析。

研究识别出七种恶性元程序，包括一种罕见的Wnt/β-Catenin黑色素细胞状态和一种在无应答者中富集的去分化神经嵴样状态。空间分析显示，同型聚集稳定了耐药程序，神经嵴样细胞形成紧凑生态位。应答者显示抗原呈递/干扰素程序富集以及协调的T细胞和B细胞扩增，而无应答者保留稳定的神经嵴样簇。表观遗传治疗重新激活转座元件，启动先天免疫并增强免疫原性。NFATC2（活化T细胞核因子胞质2）被确定为神经嵴样状态和耐药的主调控因子；其扰动促进分化和免疫原性。这些发现定义了耐药机制，并提名β-Catenin和NFATC2作为治疗脆弱点。

引言

黑色素瘤以高度异质性和细胞状态间的显著表型转换著称。这种可塑性由非遗传重编程驱动，调控可逆的转录变化，在多种分化状态之间振荡，这些状态类似于胚胎发育的不同阶段。例如，去分化黑色素瘤细胞表达类似神经嵴胚胎发育阶段的程序，与免疫治疗耐药相关。类似地，与MHC I类下调和MITFlow/AXLhigh相关的肿瘤内在程序是免疫检查点抑制剂耐药和去分化表型的标志。表观遗传重编程如何影响特定黑色素瘤细胞状态以及它们如何影响治疗反应，目前理解甚少，部分原因是缺乏合适的人类患者数据/临床数据。

近期研究表明，表观遗传药物重编程可以改变免疫微环境并影响黑色素瘤癌细胞，以及增强对免疫治疗的反应。表观遗传药物（如DNMT1抑制剂）的主要生物活性是促进新抗原表达和激活先天免疫通路的主控因子，包括I至III型干扰素、NFkB和TLR10，证实了ICI挽救适应性免疫可能与表观遗传重编程促进先天免疫协同作用的概念，从而可能解释联合治疗的临床活性。

利用bulk基因表达、甲基化和DNA测序，通过DNMT1抑制联合免疫检查点抑制实现的表观遗传免疫重编程，促进内源性逆转录病毒元件和干扰素刺激基因的上调。还证明，与遗传免疫编辑相关的肿瘤内在因素， coupled with 瘤内免疫特征，是联合治疗和免疫检查点抑制反应的有效预测因子。然而，bulk分析缺乏细胞类型分辨率，而整合单细胞技术将能够剖析响应表观遗传和免疫调节压力的精确细胞亚群。

先前使用单细胞RNA测序的研究已揭示黑色素瘤细胞中不同的转录程序，包括MITFhigh黑色素细胞和AXLhigh侵袭状态，与差异药物敏感性和可塑性相关。神经嵴样和应激相关的肿瘤特异性程序表征微小残留病，突出黑色素瘤细胞状态转换的动态性质。

结果部分 1：NIBIT-M4队列的多模态特征

研究设计：从13份冰冻肿瘤组织（5名晚期皮肤黑色素瘤患者）中，在基线（第0周）、治疗中（第4周）和较晚治疗时间点（第12周）纵向收集活检。患者分为应答者（R；完全缓解、部分缓解或疾病稳定）和无应答者（NR；疾病进展）。使用单核多组学测序（snRNA-seq和snATAC-seq）以及Visium HD空间转录组学进行分析。

细胞群体鉴定：多模态snRNA-seq和snATAC-seq数据的t-SNE显示恶性和非恶性细胞群体。TME的t-SNE按细胞类型着色，包括Tcm（T中央记忆）、Treg（调节性T细胞）、iCAF（炎性癌症相关成纤维细胞）、myoCAF（肌成纤维细胞性癌症相关成纤维细胞）等。标记基因的表达和活性以平均z-score表达（左）和缩放基因活性（右）展示。TME细胞类型组成在NR和R患者各时间点的条形图显示，ICI联合表观遗传抑制与TME的动态协调重塑相关，特征为治疗过程中进行性免疫激活和多样化。

结果部分 2：表观免疫治疗下黑色素瘤细胞状态的异质性解析

NMF框架识别七种元程序：对恶性细胞的snRNA-seq数据应用非负矩阵分解（NMF）框架，识别出七种共识元程序（MPs），代表跨肿瘤保守的 distinct 细胞身份或活动状态。每种MP具有独特的基因表达模式、强内部相关性和基因重叠。

MP分类：根据最高MP签名评分将每个恶性细胞分配到特定MP。低于简单性评分阈值0.1的细胞被定义为未定义并排除。

七种MP包括：

• Cell cycle（细胞周期）
• Melanocytic I（黑色素细胞I）
• Melanocytic II（黑色素细胞II）
• Hypoxia/EMT（缺氧/上皮-间充质转化）
• Neural crest-like（神经嵴样）
• Antigen presentation/Interferon（抗原呈递/干扰素）
• Wnt/β-Catenin

MP相似性矩阵：基于基因重叠（Jaccard指数）的MP相似性矩阵显示程序聚类并分组为元程序，每个MP用从top 60基因衍生的功能描述注释。

MP组成：R和NR患者各时间点的MP组成条形图显示，NR患者中神经嵴样MP持续存在，而R患者中抗原呈递/干扰素MP富集。

TF基序富集分析：对snATAC-seq数据中差异可及（DA）染色质区域进行TF基序富集分析。跨MP平均识别出19,787个可及峰具有显著富集。优先选择满足以下条件的基序：(i) 倍数富集≥1.3，(ii) 当多个基序对应同一TF时保留最富集的基序，(iii) 每个MP编译top 30最富集TF基序。跨七个MP共识别出113个独特TF，其中69个MP特异性TF被可视化。

关键TF：

• MITF：确认黑色素细胞MP的主要调控因子。
• Hypoxia/EMT状态：bZIP家族TF强富集（ATF3、FOS/JUN复合体、BACH1）。
• Antigen presentation/Interferon MP：IRF和STAT家族TF特异强富集。
• Wnt/β-Catenin MP：HMG-box家族TF富集（LEF1、TCF7L2）。
• Neural crest-like MP：主要由NFAT家族成员调控（NFATC2等）。

eGRN重建：使用SCENIC+管道整合分析配对的snRNA-seq和snATAC-seq多组学数据重建增强子驱动的基因调控网络（eGRNs），进一步支持相同关键TF参与调控MP特异性基因表达。在外部数据集（Pozniak等 scRNA-seq黑色素瘤队列和两个未用于推断的额外样本）中验证了调节子活性模式的稳健性和普适性。

CRE-TF-基因连锁分析：对每个TF，保留与ENCODE注释的启动子和增强子样元件重叠的基序富集峰（n=61,054），其中6.84%映射到启动子样签名（PLS），17.84%映射到近端增强子样签名（pELS），75.32%映射到远端增强子样签名（dELS）。SCENIC+推断的调控元件与ENCODE注释的增强子样签名（近端和远端）强重叠。与这些CRE相关的基因（n=16,237）与snRNA-seq差异表达分析识别的MP特异性上调基因相交，产生1953个MP特异性靶基因的高置信集。

下游通路分析：黑色素细胞发育相关通路在多个MP中富集。在dELS中，Melanocytic I和Wnt/β-Catenin MP出现 distinct 表型，突出远端元件在定义这些细胞状态中的潜在调控重要性。神经嵴样细胞显示神经发育通路和EMT相关过程（如粘着斑和ECM-受体相互作用）强富集，强化其神经起源和侵袭表型。抗原呈递/干扰素状态对炎症和抗原特异性免疫通路高度特异。

ChIP-seq验证：推断为每个MP驱动因子的TF在相应可及峰处显著富集直接结合，许多富集由黑色素瘤细胞系中进行的ChIP-seq实验支持，提供推断调控架构的正交实验确认。

结果部分 3：空间聚类稳定耐药肿瘤状态并调节表型可塑性

空间排列分析：使用Visium HD空间转录组学分析MP在组织中的空间排列。代表性R患者和NR患者的空间排列图显示，NR患者中神经嵴样MP形成紧凑生态位。

MP组成：NR和R患者各时间点的MP组成条形图显示，NR中神经嵴样MP持续存在，R中抗原呈递/干扰素MP富集。

肿瘤状态邻近评分（TSPS）：每种MP的TSPS分布显示，Wnt/β-Catenin程序呈现不寻常的双峰分布，表明其同时存在于聚集和分散状态。

配对相关性和统计显著性：神经嵴样和Wnt/β-Catenin细胞的聚集组和分散组之间表达谱的配对相关性和统计显著性（双尾Mann-Whitney U检验P值）显示，聚集细胞具有更高的转录同质性和维持状态及空间构型的更高概率。

外周定位指数（PLI）：每种MP的PLI测量簇定位于组织边界附近的倾向。神经嵴样MP具有最高的PLI（P=2.7e-10），表明其富集于边界。Cell cycle MP具有最低的PLI（P=2.5e-07），表明中心富集。

空间共定位模式：MP之间的空间共定位模式（上三角）和转录相关性（下三角）显示，抗原呈递/干扰素和缺氧/EMT程序显示最高的同型转换概率。

结论：空间聚类和分散构成黑色素瘤中的平行组织策略：由同型粘附稳定的聚集生态位保持状态身份并可能促进治疗耐药，而分散细胞提供异质性和适应潜力的来源。

结果部分 4：恶性和免疫细胞的空间协调是反应异质性和生态系统架构的基础

非恶性亚群注释：使用与恶性细胞相同的OT方法注释非恶性亚群。与RNA-seq模式一致，NR患者的TME在整个治疗过程中保持免疫抑制，以持续基质元件和最小免疫浸润为标志。相比之下，R患者显示M1巨噬细胞、T细胞、B细胞和浆细胞进行性增加，反映空间活跃的免疫参与和向抗肿瘤免疫的转变。

肿瘤轮廓 delineation：使用核密度估计（KDE）和形态学操作为每个样本 delineate 肿瘤轮廓。与先前报道一致，观察到R患者中T细胞浸润显著高于NR患者。这一发现在高分辨率Xenium空间转录组数据中得到进一步证实。

局部邻域组成：量化肿瘤细胞的局部邻域组成，评估哪些恶性状态优先富集在 distinct 非恶性细胞类型附近。在R患者中，抗原呈递/干扰素程序与B和T细胞强共定位，反映这些区域内活跃的免疫反应。在代表性R患者中，抗原呈递/干扰素肿瘤细胞与淋巴细胞之间的紧密邻近区域表明增强的抗原加工和呈递，促进T和B细胞激活和有效抗肿瘤免疫。

生态型识别：开发无监督计算管道定义生态型，即跨组织切片的细胞状态复现空间组成模式。识别出五种生态型：Antigen-presentation/Inflamed（抗原呈递/炎症型）、Hypoxia（缺氧型）、Immune-stroma interface（免疫-基质界面型）、Keratinocyte epithelium（角质形成细胞上皮型）和Tumor core（肿瘤核心型）。在代表性标本中，抗原呈递/炎症型生态型占主导并与免疫-基质界面区域混合，反映R患者典型的激活免疫微环境。相比之下，NR肿瘤以肿瘤核心和缺氧生态型为主， coupled with 基质富集和有限免疫浸润。

结果部分 5：TE重新激活驱动免疫信号并贡献于肿瘤-免疫动态

TE活性量化：利用针对单细胞测序中TE位点特异性量化的多模态整合框架（MATES），分析主要TE类别的表达和染色质可及性，包括LINEs、SINEs、LTRs和其他重复元件。TE衍生信号对解析TME细胞架构高度信息丰富，共嵌入t-SNE分析分离基质、T细胞和巨噬细胞亚群。TE活性反映跨转录MP的恶性细胞异质性，揭示肿瘤细胞状态的连续体而非 sharply segregated 簇。

DNMTi增加TE活性：治疗前（第0周）与治疗中（第4周）TME细胞的差异分析显示，DNMTi增加TE活性，在染色质可及性（x轴）和转录表达（y轴）水平均明显。一部分TE在治疗后显示同时高可及性和表达，包括SINE Alu元件（如AluYb8和AluYf1）、LTR元件（如MERT7B和LTR1）和LINE-1元件（如LIP3）。Alu元件代表人类基因组中一些最进化上最近和转录活跃的TE，表明DNMTi治疗优先重新激活年轻、转录competent元件。相比之下，不同TE家族（如LTR元件MLT1G和MLT1G3）主要在可及性水平显示重新激活，无相应转录上调。这种模式提示此类元件的潜在顺式调控作用。观察到特定MLT1G位点与注释为PTPRC（CD45）增强子的可及染色质区域重叠。

TE贡献于恶性身份：识别跨MP的差异表达和可及TE。沿黑色素瘤分化轴（从高度分化的Melanocytic I状态到干细胞样去分化神经嵴样状态）检查TE参与。Alu元件在Melanocytic I肿瘤细胞中选择性重新表达，已知其在病毒模拟和激活先天免疫感知中的作用，可能增强对表观遗传治疗的反应性。LTR元件（包括多个ERV和MER家族）优先与抗原呈递/干扰素和缺氧/EMT程序相关。LINE元件显示更选择性和异质性激活，富集于增殖和神经嵴样程序。SINE元件（特别是Alu和MIR家族）在多个MP中显示广泛一致的可及性和表达。

TE-TAAs：通过严格计算工作流识别84个高置信TE位点具有产生TAA的潜力，对应154个独特TE衍生序列具有预测抗原性。从识别的TE衍生序列池中生成99个独特核心肽序列（最小8聚体长度）的非冗余集。查询31个来自黑色素瘤和其他肿瘤类型的MS-based免疫肽组学数据集，发现37.4%的肽被MS确认为HLA-I呈递配体。定义免疫编辑细胞为同时(i)在可能产生TE-TAA的TE位点显示表达和染色质可及性，且(ii)匹配相应患者中识别的免疫原性TE-TAA的细胞。只有属于抗原呈递/干扰素状态的肿瘤细胞在治疗后下降，与TE衍生抗原驱动的潜在免疫介导清除一致。

结果部分 6：NFATC2驱动对ICI和表观免疫治疗的耐药，其靶向使神经嵴样黑色素瘤向分化表型转变

临床相关性分析：分析八个先前发表的黑色素瘤患者队列（n=402，R=152，NR=250），这些患者接受不同ICI治疗，肿瘤在治疗前和/或治疗后通过bulk转录组学分析。使用基于MP特异性基因签名的去卷积方法估计每种MP在bulk肿瘤样本中的比例。

关键发现：

• R患者肿瘤在ICI治疗前后均显著富集抗原呈递/干扰素状态（Wilcoxon检验，P=0.003和0.031），突出其治疗反应预测价值。
• Melanocytic I/II状态在治疗前NR中更丰富（P=0.017和0.025）。
• 去分化神经嵴样细胞在治疗后特异性富集于NR中（P=0.015）。
• 神经嵴样细胞比例较高与ICI治疗前后较差的总生存显著相关。
• 抗原呈递/干扰素与更好OS相关（log2HR=-0.41，P=0.002）。
• 多变量Cox比例回归调整年龄、性别、疾病分期和BRAF/NRAS突变状态后，抗原呈递/干扰素独立与改善OS相关。

计算扰动分析：使用SCENIC+确定扰动关键主调控TF表达如何影响神经嵴样细胞状态。在候选者中，模拟沉默NFATC2产生最显著效果，提名其为耐药神经嵴样状态的中心调控因子。

NFATC2调节子：从独立单细胞数据集推断NFATC2调节子，包含56个基因。该调节子包含与胚胎发育、侵袭、迁移和神经发生相关的基因，包括AP-2家族成员TFAP2C和TFAP2B，以及CSPG4和CAV1（肿瘤细胞侵袭和迁移的关键驱动因子），以及MAP2和SEM3D（神经元分化和轴突生长标记）。NFATC2调节子的转录活性预测ICI治疗的继发性耐药（AUC=0.7），在NR样本中治疗前后均显著更高（P=0.007和0.001）。

NFATC2敲低实验：分析来自手术标本的黑色素瘤细胞系（Me71）中稳定的NFATC2敲低数据。Me71表达更高水平的神经嵴样和神经嵴样过渡程序，显示黑色素细胞分化程序激活较低。通过重叠每种MP的top 50差异表达基因与NFATC2沉默细胞的DEGs，发现细胞周期和神经嵴样程序的稳健失活。关键下调基因包括CHEK1、POLE和CENPF（细胞周期）以及PRICKLE2、SDC2和TFAP2B（神经嵴样）。基因集富集确认DNA复制和EMT转换的抑制，伴随干扰素介导信号和黑色素细胞分化相关通路（如色素生物合成过程）的增加。观察到向更分化的Melanocytic II状态的转录转变（Fisher方法，P=4.4×10^-4），伴随色素沉着通路的重新激活，同时激活干扰素介导信号，包括抗原呈递/干扰素MP特定基因（TAP1、B2M、STAT1和IFIH1）的上调。

结论：NFATC2是神经嵴样黑色素瘤状态的关键调控因子，将增殖和迁移程序与治疗耐药耦合。NFATC2沉默不仅逆转这种耐药状态，还促进分化和免疫原性重编程，突出NFATC2作为侵袭性黑色素瘤的潜在治疗脆弱点。

讨论

核心发现：对纵向肿瘤活检的多组学和空间解剖提供了表观免疫治疗如何重塑黑色素瘤生态系统的机制框架。识别出导致治疗敏感性和耐药的肿瘤细胞状态和调控程序，揭示可操作的脆弱点。

细胞状态异质性：确认了先前bulk and 单细胞研究建立的 discrete 黑色素瘤细胞状态，但关键的是展示了它们在DNMT1抑制和CTLA-4阻断联合下如何动态演变。特别是揭示了黑色素细胞区室内的大量异质性，解析出三种 distinct 转录程序。其中一种程序独特地表征为Wnt/β-Catenin信号通路激活，由LEF1强表达证明。这代表一种先前未被充分认识的黑色素细胞亚状态，对免疫逃逸和治疗耐药具有潜在相关性。

去分化的双重角色：虽然未观察到去分化与耐药之间的简单关联，但比较分析显示抗原呈递/干扰素MP（与反应最强相关的状态）显示最高的干性评分之一，与神经嵴样程序相当。因此，在数据集中，反应相关状态与干性和去分化特征重叠，而非代表严格分化的黑色素细胞表型。这些发现表明去分化并非统一耐药机制；其临床影响似乎取决于伴随的表观遗传和转录背景。

空间组织的作用：研究强调空间组织在塑造黑色素瘤细胞状态及其功能稳定性中的关键作用。通过整合TSPS分析与基于轨迹的转换建模，证明聚集肿瘤细胞表现出更大的转录同质性和维持状态及空间构型的更高概率。这些发现表明空间聚类强化细胞状态身份，而分散促进转录异质性和状态不稳定性。提出差异同型粘附作为癌症中的组织原则，在聚集生态位中保持细胞身份，在分散细胞中 enabling 可塑性。

Wnt/β-Catenin的双峰分布：β-Catenin在粘着连接处稳定钙粘蛋白介导的同型粘附，促进凝聚架构，而在细胞核中作为转录共激活因子，驱动与可塑性、侵袭和免疫逃逸相关的程序。聚集和分散Wnt/β-Catenin亚群的共存可能反映β-Catenin的这两种角色。

TE的双重角色：结果支持并扩展先前工作，显示表观遗传药物可通过诱导病毒模拟和先天免疫信号增强对ICI的反应性。证明TE重新激活具有双重角色：作为CRE启动免疫激活，以及在trans中产生被T细胞清除的TE衍生抗原。揭示TE重新激活与抗原呈递/干扰素状态之间的反向关联，支持肿瘤免疫编辑在表观遗传治疗背景下高度依赖此类细胞状态的假设。

NFATC2作为主调控因子：先前研究已将NFATC2与MITF^low黑色素瘤中的EMT样转换和耐药相关联。研究将NFATC2识别为特定治疗耐药细胞状态的主调控因子，将侵袭行为和免疫逃逸联系起来。发现直接将NFATC2与驱动神经嵴样表型本身相关联，提供细胞状态与治疗失败之间的机制联系。这使NFATC2抑制成为克服对表观免疫治疗的原发性和获得性耐药的合理治疗策略。

局限性：

• 患者数量少和采样时间点有限/技术挑战（如获取足够高质量组织）是概念验证试验固有的。
• 需要更大规模研究来推广部分观察结果。
• 研究依赖计算和正交验证策略支持推断调控网络和预测TAA的生物学相关性。
• 需要前瞻性收集样本和直接实验测定来将这些发现转化为临床应用。
• 预测TE衍生TAA的功能验证将确认其免疫原性潜力和临床相关性。

材料与方法

样本收集：从5名晚期皮肤黑色素瘤患者收集13份冰冻肿瘤组织，患者接受递增剂量DNA去甲基化剂guadecitabine（30-60 mg/m²/天，皮下，第1-5天）联合标准抗CTLA-4 ipilimumab（3 mg/kg，静脉，第1天），共四个治疗周期。纵向收集基线（第0周）、治疗中（第4周）和较晚治疗时间点（第12周）活检。

10x Genomics单核多组学（RNA + ATAC）测序：使用Nuclei分离试剂盒从13份冰冻组织分离核。每个样本使用3000-10,000个核生成单细胞多组学文库。测序在Novaseq X Plus上进行。

Visium HD空间基因表达分析：FFPE组织由认证病理学家审查并放置在Visium载玻片上。空间基因表达文库按照Visium HD空间基因表达试剂盒生成。测序在Novaseq X Plus上进行。

数据处理与统计分析：

• 单核多组学数据处理：Cell Ranger ARC（v2.0.2）管道，GRCh38参考。RNA和ATAC分别用Seurat（v5.1.0）和Signac（v1.14.0）处理。QC后保留58,670个高质量核（RNA）和55,850个核（ATAC）。整合两种模态用于多组学聚类（n=38,029）。
• 恶性和非恶性细胞区分：使用SCEVAN包（v1.0.3）整合单细胞表达数据与推断CNA。
• 恶性细胞MP识别：对恶性细胞相对基因表达谱独立应用NMF。保留稳健非冗余NMF程序（75个），基于成对Jaccard相似性分组为MP。
• 恶性细胞分类为MP状态：使用AddModuleScore计算每种MP签名评分。简单性评分≥0.1的细胞被 confident 分配。
• 跨模态一致性分析：使用Seurat进行跨模态标签转移。
• TF基序富集分析：对DA峰进行。使用HOCOMOCO v13数据库的TF位置权重矩阵。倍数富集≥1.3的基序保留。
• CRE-TF-基因连锁分析：基于ENCODE cCRE注释将基因映射到PLS、pELS和dELS。
• eGRN分析：使用SCENIC+（v1.0a2）从多组学数据推断eGRNs。
• ChIP-seq富集分析：将DA染色质峰提交至ChIP-Atlas富集分析模块。
• Visium HD数据处理：使用StarDist进行核分割，聚合8 μm条形码方块。OT用于RNA-seq和Visium HD之间的注释转移。
• 恶性和非恶性空间相互作用：基于欧几里得空间距离的肿瘤邻域分析框架。置换检验（N=100）评估统计显著性。
• 外周定位指数（PLI）：测量细胞cluster定位于组织边界附近的倾向。
• 肿瘤状态邻近评分（TSPS）：评估表型 distinct 肿瘤状态的空间聚类。
• 生态型识别：两阶段管道：(i) 样本内局部生态型发现，(ii) 跨样本共识元聚类。
• TE分析：从UCSC RepeatMasker检索重复DNA特征定位。使用MATES估计TE位点水平计数。差异表达和可及性分析使用scoreMarkers函数。
• TE-TAAs：开发计算工作流识别TE-TAAs，包括肿瘤表达和可及TE、潜在肽编码TE检测、假阳性TE衍生肽过滤、MHC-I结合预测和高置信TE-TAAs。
• 独立黑色素瘤队列验证：从Tumor Immunotherapy Gene Expression Resource获取六个数据集，从cBioPortal和GEO获取两个额外数据集。使用CIBERSORTx推断MP组成。
• 生存分析：MP评分作为连续变量分析。使用Kaplan-Meier方法和logrank检验。Cox比例风险回归模型估计HR和95% CI。
• 预后评估：使用留一交叉验证（LOOCV）和广义线性模型。ROC分析和AUC计算。
• 计算机扰动分析：使用SCENIC+工作流对选定TF进行模拟扰动。
• 外部scRNA-seq黑色素瘤数据集中的基因调控网络推断：使用pySCENIC（v0.12.1+8.gd2309fe）推断GRNs。
• NFATC2转录后活性：使用decoupleR（v2.9.7）在bulk RNA-seq数据集上量化NFATC2调节子活性。
• 黑色素瘤细胞系中NFATC2敲低：从GEO（GSE101323）获取NFATC2敲低和对照黑色素瘤细胞的基因表达数据。使用limma（v3.58.1）进行差异表达。

关键结论

1. 七种恶性元程序：包括罕见的Wnt/β-Catenin黑色素细胞状态和NR中富集的去分化神经嵴样状态。
2. 空间聚类稳定耐药：同型聚集稳定耐药程序，神经嵴样细胞形成紧凑生态位。聚集细胞具有更高的转录同质性和维持状态的更高概率。
3. TE重新激活的双重角色：作为CRE启动免疫激活，以及在trans中产生被T细胞清除的TE衍生抗原。TE-TAAs在抗原呈递/干扰素状态中驱动免疫编辑。
4. NFATC2作为主调控因子：驱动神经嵴样状态和耐药。其沉默促进分化和免疫原性重编程，重新激活色素沉着通路和干扰素信号。
5. 治疗脆弱点：β-Catenin和NFATC2被提名为治疗脆弱点。NFATC2抑制可能克服对表观免疫治疗的原发性和获得性耐药。
6. 空间组织原则：差异同型粘附作为癌症中的组织原则，在聚集生态位中保持细胞身份，在分散细胞中 enabling 可塑性。
7. 临床意义：抗原呈递/干扰素MP与更好OS相关，神经嵴样MP与较差OS相关。这些MP的比例可用于预测治疗反应和生存。

生活很好，有你更好。