文献分享（visium HD）--多基质细胞类器官共培养模型揭示胰腺癌和胰腺炎中的上皮–成纤维细胞异质性

作者，Evil Genius

今天我们分享visium HD的文献

整体研究背景与目的

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命的恶性肿瘤，其肿瘤微环境（TME）富含大量的成纤维细胞（CAFs）和细胞外基质。慢性胰腺炎是PDAC的重要危险因素，但两者在成纤维细胞重编程、上皮-成纤维细胞相互作用方面的差异尚不清楚。现有模型（如雨蛙素诱导的胰腺炎小鼠模型）虽能模拟部分病理特征，但难以精细解析上皮-成纤维细胞的对话。本研究旨在通过分析人类和小鼠的胰腺炎及PDAC组织，并结合新建立的类器官/多基质共培养模型，系统比较两种疾病状态下的上皮细胞和成纤维细胞特征。

结果 1：肌成纤维细胞在人类和小鼠PDAC中相对于胰腺炎更为富集

• 人类组织学分析：对PDAC患者的手术样本及其匹配的慢性胰腺炎邻近组织进行染色，发现虽然总体胶原沉积差异不大，但成纤维细胞亚群不同：PDAC中αSMA⁺（肌成纤维细胞标志物）表达更高，而胰腺炎中PDGFRα⁺（成纤维细胞标志物）表达更高。
• 人类单细胞/单核RNA测序（scRNA-seq/snRNA-seq）：
  • 对已发表的人类PDAC（n=5）和慢性胰腺炎（n=4）的scRNA-seq数据分析，鉴定出PDAC中的经典CAF亚群（myCAF、iCAF），而胰腺炎中则有5个成纤维细胞亚群（WT1^high CDS1high、P16high、FAPhigh、DCNhigh DPP4high、CXCL12high）。
  • 基因集富集分析（GSEA）显示：PDAC的CAFs上调肌成纤维细胞相关通路（平滑肌收缩、胶原形成），而PDAC恶性细胞上调增殖和炎症通路；相比之下，胰腺炎成纤维细胞上调炎症通路（如干扰素γ应答）。
  • 整合另一个snRNA-seq数据集（人类PDAC n=4，慢性胰腺炎 n=3）进一步验证了上述发现，并提示胰腺炎成纤维细胞更具炎症表型，而PDAC CAFs更具肌成纤维表型。

• 小鼠模型验证：
  • 采用C57BL/6J小鼠，雨蛙素处理6周（慢性胰腺炎）或2天（急性胰腺炎），并与KPC基因工程小鼠（Kras^G12D; Trp53^R172H; Pdx1-Cre）的PDAC组织进行比较。
  • 组织学证实：胰腺炎和急性胰腺炎均出现腺泡-导管化生（ADM，CK19⁺增加）、免疫细胞浸润和纤维化（PDGFRα、PDPN、αSMA、Masson染色增加），但慢性胰腺炎更显著，更符合人类慢性炎症状态。
  • 关键发现：PDAC中αSMA⁺肌成纤维细胞显著高于胰腺炎，而胰腺炎中PDGFRα、PDPN和胶原沉积更高，这与人类数据一致。
• 空间转录组学（Visium HD）：正常胰腺以腺泡细胞为主；胰腺炎中成纤维细胞最丰富；PDAC中恶性细胞和成纤维细胞占优势。伪批量分析显示PDAC CAFs中肌成纤维特征基因上调。

结果 2：小鼠模型重现人类胰腺炎和PDAC的上皮与成纤维细胞特征

• 小鼠胰腺炎和PDAC的snRNA-seq分析（胰腺炎 n=6，PDAC n=4）：
  • 在PDAC中鉴定出myCAF、iCAF、apCAF三个亚群；在胰腺炎中鉴定出4个成纤维细胞亚群：Fibro 1（Wt1^high CdS1^high）、Fibro 2（Pdgfra^high）、Fibro 3（Fap^high）、Fibro 4（Wt1^high Dcn^high Dpp4^high）。
  • 通过多重RNA原位杂交（ISH）和免疫荧光（IF）证实这些亚群空间上交错分布，并具有不同分泌特征（如IL34、P16、Vegfc、Muc16等）。
  • 比较分析显示：胰腺炎Fibro 3与PDAC CAFs转录组最相似（富集PDAC CAF特征基因），且通过scANVI映射发现Fibro 3与iCAF相似度最高（43%），Fibro 2与myCAF相似（42%），Fibro 1和4与apCAF相似。
  • 伪时间轨迹分析提示Fibro 3可能是PDAC CAFs的前体细胞。
• 信号通路差异：与人类一致，PDAC CAFs上调肌成纤维特征，胰腺炎成纤维细胞上调炎症特征（尤其Fibro 4干扰素应答最高）。Pdgfra在胰腺炎中高表达，Acta2（αSMA）在PDAC CAFs中高表达。
• 细胞间通讯（CellChat和NicheNet）：ECM相关配体（胶原、纤连蛋白）在胰腺炎和PDAC中成纤维-上皮信号差异明显；PDAC中Tgfbl、Col1a1、Tnc等肌成纤维相关介质占主导。
• 不同遗传背景的PDAC（SMAD4缺陷）验证：使用KP（Smad4野生型）和KPAS（Smad4敲除）原位移植模型，snRNA-seq显示即使SMAD4缺失，PDAC CAFs仍比胰腺炎成纤维细胞具有更强的肌成纤维特征，表明该特征在多种遗传背景下保守。
• 跨物种比较：将小鼠PDAC CAFs与胰腺炎成纤维细胞的差异表达基因与人类对应基因比较，发现约28%的人类PDAC CAF上调基因与小鼠重叠，54%的人类胰腺炎成纤维细胞上调基因与小鼠重叠，说明模型能部分重现人类基因表达模式。但某些炎症特征在年轻小鼠模型中可能被低估（提示年龄因素）。
• 上皮细胞分析：胰腺炎中有两个导管细胞群（Ductal 1和Ductal 2），PDAC有一个恶性细胞群。Ductal 1更接近PDAC恶性细胞（签名富集，伪时间轨迹连接）。空间分析显示Fibro 3与Ductal 1并非形成孤立微环境，而是分散分布。PDAC恶性细胞上调增殖通路，而相对于Ductal 1还上调ECM和炎症通路。
• 跨物种上皮基因重叠：约43%的人类PDAC恶性上调基因与小鼠重叠，47%的人类胰腺炎导管上调基因与小鼠重叠。

结果 3：胰腺炎类器官（P类器官）重现体内导管细胞基因表达

• 建立类器官模型：从雨蛙素处理6周的小鼠胰腺建立胰腺炎类器官（P类器官），并与正常胰腺类器官（N类器官）和KPC PDAC类器官比较。
• 形态与生长：P类器官初始形成小而松散的不规则囊状结构，生长速度慢于N和PDAC类器官；传代后形态趋于相似，但P类器官增殖相关通路（RNA-seq）显著低于N和PDAC。
• 转录组特征：
  • P类器官上调ECM相关和炎症通路（如JAK-STAT），STAT3磷酸化水平高于PDAC类器官。
  • PDAC类器官富集PDAC恶性细胞签名，而P类器官富集胰腺炎Ductal 1和Ductal 2的基因签名。
  • P类器官中上调的基因与体内胰腺炎导管细胞标志物显著重叠，表明P类器官保留了体内炎症导管细胞的特征。
• 结论：P类器官是研究胰腺炎上皮-成纤维细胞相互作用的合适模型。

结果 4：成纤维细胞信号对胰腺炎导管细胞的塑造作用强于对PDAC恶性细胞

• 共培养实验设计：将P类器官或PDAC类器官分别与胰腺星状细胞（PSCs）共培养，并与单培养对照比较。
• 细胞比例：P共培养中PSCs数量增加更显著，成纤维/上皮比例更高，与体内胰腺炎组织特征一致。
• 转录组影响：
  • 无论是否共培养，PDAC类器官增殖通路均高于P类器官。
  • 共培养条件下，P类器官强烈上调PDGF、TGF-β、NOTCH等信号通路，而PDAC类器官变化较小。
  • 与单培养相比，P类器官在共培养中更显著地富集胰腺炎Ductal 1的基因特征，提示Ductal 1状态部分依赖基质信号。
• 跨模型重叠：P类器官共培养上调基因与体内胰腺炎导管细胞标志物显著重叠（包括PDGFD、PDGFC、TGFBR1、SPARC、NOTCH2等）。蛋白质验证：P类器官中SOX9、SOX4、DPP4蛋白水平高于PDAC类器官。
• PDAC类器官共培养：PDAC类器官共培养上调的基因（如TOP2A、SLC2A1、GCNT3、MUC5AC、CDKN2A等）与体内PDAC恶性标志物重叠。特别是p19（小鼠Cdkn2a-202，对应人p14）在PDAC中上调，而p16（Cdkn2a-201）无差异，且p19随Kras/Trp53突变状态升高（KC→KPC→PDAC）。
• PSCs对基因表达的影响程度：共培养诱导的差异基因中，P类器官有约20%受PSC信号调控（如Tgfbr1、Sparc），而PDAC类器官仅约3%，表明胰腺炎导管细胞转录组更依赖于成纤维细胞信号。

结果 5：类器官/PSC共培养仅部分重现体内胰腺炎与PDAC成纤维细胞差异

详细总结：

• PSC激活状态：与P或PDAC类器官共培养后，PSCs均被激活（下调静息标志物Plin4、Kitl，上调炎症和肌成纤维标志物）。但PDAC共培养的PSCs炎症标志物（Il1a、Il6、Cxcl1）和炎症通路更高。
• 分子机制：
  • 上皮来源的TNF和TGF-β在P和PDAC类器官中表达相似，但IL-1α（Il1a）在PDAC类器官中更高，IL-1β仅在PDAC共培养中升高。
  • 条件培养基实验和IL-1α中和抗体、Il1r1敲除PSCs证实，PDAC类器官分泌更多的IL-1α，是导致PSCs更强炎症反应的主要原因。
• 与体内成纤维细胞基因重叠：
  • P共培养中PSCs上调的基因（P PSC markers）与体内胰腺炎成纤维细胞标志物显著重叠。
  • 但PDAC共培养中PSCs上调的基因（PDAC PSC markers）与体内PDAC CAF标志物无显著重叠，说明单纯PSC共培养无法完全模拟PDAC CAF的肌成纤维特征。
• 结论：需要更多基质细胞类型（如混合成纤维细胞、间皮细胞）才能更好地再现体内成纤维细胞表型。

结果 6：跨模型分析鉴定出胰腺炎和PDAC的上皮标志物

• 多基质共培养建立：在共培养中加入GFP标记的PSCs、TdTomato标记的混合成纤维细胞（含成纤维细胞和间皮细胞）和间皮细胞，构建“多基质”共培养体系。
• 细胞比例：P多基质共培养中PSCs扩增更显著，基质/上皮比值更高，与体内胰腺炎相似。
• 上皮细胞转录组（scRNA-seq）：
  • 鉴定出两个P类器官群（P1和P2）和一个PDAC类器官群。PDAC恶性签名在PDAC最高，P1次之，P2最低；胰腺炎Ductal 1签名在P1中富集。
  • 与单培养相反，在多基质共培养中，PDAC类器官相对于P类器官上调了炎症和ECM通路，表明基质信号是诱导PDAC炎症表型所必需的。
• 跨物种/跨模型重叠：P类器官多基质共培养上调基因与体内胰腺炎导管标志物重叠；PDAC类器官多基质共培养上调基因与体内PDAC恶性标志物重叠。
• 整合分析定义核心标志物：整合小鼠体内和两种共培养系统数据，得到177个胰腺炎导管核心标志物（如SOX9、STAT1）和254个PDAC恶性核心标志物（如MUC5AC、CD44）。多重IF验证：小鼠PDAC中MUC5AC⁺CK19⁺和CD44⁺CK19⁺上皮细胞更多，而胰腺炎中SOX9⁺CK19⁺和STAT1⁺CK19⁺更多。
• 不同遗传背景验证：在KAP（p53-null）和KPAS（SMAD4缺陷）PDAC模型中，MUC5AC和CD44仍高于胰腺炎，但程度略有差异；SOX9在胰腺炎中显著富集，表明这些标志物在不同基因型中基本保守。

结果 7：多基质共培养更好地模拟胰腺炎和PDAC的成纤维细胞异质性

详细总结：

• 多基质共培养优势：与单一PSC共培养相比，多基质共培养（含PSCs、混合成纤维细胞、间皮细胞）的转录组数据中，PDAC多基质细胞显著富集肌成纤维特征（如myCAF签名），而PSC单一共培养未能捕捉到。
• 不同基质细胞类型的响应差异：
  • PDAC类器官诱导PSCs、混合成纤维细胞和间皮细胞均上调肌成纤维和炎症信号，但存在细胞类型特异性：混合成纤维细胞（而非PSCs或间皮细胞）在PDAC条件下下调干扰素应答、上调胶原相关通路，这与体内PDAC CAFs vs 胰腺炎成纤维细胞的差异一致。
  • 细胞通讯分析显示PDAC恶性细胞与PSCs交流更多，但与混合成纤维细胞和间皮细胞交流较少；IL-1通路中Il1a是主要恶性-基质配体。
• 体外对TGF-β和IL-1α的反应性：混合成纤维细胞和间皮细胞对TGF-β更敏感（上调肌成纤维标志），而PSCs对IL-1α更敏感（上调炎症标志）。STAT3激活在PSCs中更强，而混合成纤维细胞和间皮细胞对LIF（P类器官高表达）更敏感。
• 跨模型重叠显著提高：
  • P多基质 vs PDAC多基质上调的基因与体内胰腺炎成纤维细胞标志物重叠率达48%（PSC共培养为48%，但此处为60%？原文：48% of P PSC markers 和60% of P multi-stroma markers；PDAC多基质与PDAC CAF标志物重叠率从15%（PSC共培养）提升到31%）。
  • 人类跨物种比较也显示多基质共培养的PDAC基质细胞与人类PDAC CAF标志物显著重叠，而PSC共培养无此效果。
• 蛋白水平验证：多重IF证实胰腺炎中PDGFRα⁺αSMA⁻PDPN⁺和CD34⁺成纤维细胞富集，PDAC中αSMA⁺PDGFRα⁻PDPN⁺、FN1⁺、TNC⁺、RUNX1⁺、CD56⁺成纤维细胞富集，且在不同遗传背景下均成立。人类样本中也观察到类似模式（CD34⁺在慢性胰腺炎，FN1⁺在PDAC）。
• 胰腺炎来源的混合成纤维细胞（P-混合成纤维）：从胰腺炎小鼠中分离的混合成纤维细胞，在P类器官条件培养基下炎症反应更强，而在PDAC条件培养基下则向肌成纤维方向转化。P→PDAC顺序共培养的基质细胞处于中间转录状态，表明炎症基质可被恶性信号重编程但仍保留部分炎症特征。
• 谱系起源推断：通过scANVI将体外基质细胞映射到体内成纤维细胞亚群，发现胰腺炎Fibro 1和4主要与间皮细胞相似（85%），Fibro 2与混合成纤维细胞相似（51%），Fibro 3与混合成纤维细胞（33%）和PSCs（38%）均相似。PDAC CAFs则显示出更复杂的组合特征，提示多种起源。

主要结论与意义

• 核心发现：本研究揭示了胰腺炎和PDAC在成纤维细胞和上皮细胞方面的显著差异，PDAC以肌成纤维特征为主，胰腺炎以炎症特征为主。多基质类器官共培养模型比单一PSC共培养更好地再现了疾病特异性细胞状态和相互作用。
• 模型优势与局限性：小鼠模型和体外共培养能捕捉大部分人类基因特征，但部分炎症程序（如老年患者中的炎症信号）未完全再现，可能与小鼠年龄、遗传背景、免疫环境等因素有关，未来需纳入老龄和遗传多样性模型。
• 临床意义：慢性胰腺炎是PDAC风险因素，鉴定疾病特异性上皮-成纤维细胞信号轴（如IL-1、LIF/STAT3）可能为早期检测和干预提供靶点。胰腺炎成纤维细胞可被恶性细胞重编程，但仍保留炎症特征，可能反映肿瘤演化中的中间状态。
• 成纤维细胞标志物：PDGFRα⁺αSMA⁻（胰腺炎）vs αSMA⁺PDGFRα⁻（PDAC）的差异具有诊断潜力，且在不同遗传背景下稳定，支持使用基质标志物进行高危人群的早期检测。
• 基质细胞起源：胰腺炎成纤维细胞和PDAC CAFs可能源于不同前体细胞（间皮细胞、混合成纤维细胞、PSCs），需要谱系示踪进一步验证。
• 未来方向：可延长共培养时间、调节基质比例、加入免疫细胞和内皮细胞，以及使用遗传性胰腺炎模型，以更全面模拟疾病。

最后，来看看分析方法

visium HD

生活很好，有你更好。