课前准备--蛋白质组学--单细胞空间组学-基因组学指导的癌症基因组体细胞突变解读

作者，Evil Genius

无论做什么事情，我们先把事情做好，再说其他的内容，我认为这个内容非常重要，即使只有一个人参加培训，我也想好好全流程梳理一下，根本出发点就是想把这个组学搞明白。

今日参考文献

将大规模癌症基因组突变数据与蛋白质三维结构、功能结构域、结构稳定性以及临床数据整合起来，从“基因层面”进一步深入到“突变所在区域/结构位置层面”，判断一个突变到底可能通过什么机制影响癌症发生发展。

研究规模非常大：

139,818 名患者

18+ 癌症类型

173 个癌症相关基因

最终建立：

Significantly Mutated Regions，SMRs——显著突变区域

并把这些区域映射到蛋白质三维结构上。

文章想解决的问题并不是：“哪个基因发生突变？”

而是：“这个基因的哪个区域发生突变？这个区域在蛋白质三维结构中处于什么位置？它对应什么功能？为什么这个位置的突变会导致癌症？”

也就是

DNA mutation

↓

突变位置

↓

蛋白质结构位置

↓

功能结构域/结合界面

↓

蛋白质功能改变

↓

肿瘤发生

↓

临床表型/治疗反应

Introduction——为什么要做这个研究？

传统癌症基因组研究的问题

过去大量 TCGA、ICGC 等研究告诉我们：

哪些基因经常发生突变。

例如：

• TP53
• KRAS
• EGFR
• PIK3CA
• PTEN
• ERBB2

但是仅仅知道：

TP53发生突变

是不够的。

因为一个蛋白质往往包含多个不同的功能区域。

例如受体酪氨酸激酶：

胞外结构域

→ 配体结合

跨膜结构域

→ 信号传递

胞内激酶结构域

→ ATP结合、磷酸化

所以：

同一个基因不同位置的突变，可能产生完全不同的生物学后果。

突变的功能不仅取决于基因，还取决于突变残基在蛋白质三维空间中的位置。

提出的核心假设

文章提出：

如果能够研究癌症突变在蛋白质上的“空间分布”，就可以发现这些突变真正影响的功能。

因此，他们不再把蛋白质看成：

A-B-C-D-E-F-G-H-I-J

而是：

突变
              ↓
      ┌─────────────┐
      │  蛋白三维结构 │
      │             │
      │ DNA结合区域  │
      │             │
      │ 配体结合区域 │
      │             │
      │ 蛋白核心     │
      └─────────────┘

即：

从线性基因组突变 → 三维蛋白质突变。

建立 Proteo-genomics framework

输入数据

首先整合：

癌症基因组数据

139,818 名患者

18+ 肿瘤类型

↓

获得大量：

• missense mutation
• nonsense mutation
• frameshift
• truncating mutation 等

然后过滤：

• 低质量样本
• 低可信度突变
• 潜在生殖系突变

最终分析：

173 个癌症相关基因。

如何寻找“显著突变区域”？

没有简单地：

“哪个位置突变多，就认为哪个位置重要。”

这是非常关键的一点。

因为某些DNA序列本身就容易发生突变。

例如：

DNA序列背景
      ↓
局部突变率不同
      ↓
某些位置天然容易突变

如果不校正：

很容易把“天然高突变率”误认为“癌症选择”。

使用 Hidden Markov Model

构建了一个：

Hidden Markov Model，HMM

寻找：

Significantly Mutated Regions，显著突变区域。

这个模型不仅考虑：

① 实际突变数量

还考虑：

② nucleotide context

也就是：

DNA序列背景导致的基础突变率。

同时考虑：

③ pathogenicity

使用：

AlphaMissense

评价氨基酸位置潜在致病性。

模型还使用：

Poisson-lognormal distribution

描述大规模人群数据中突变数量的过度离散和长尾分布。

因此模型寻找的是：

超过“背景突变率 + 序列环境 + 其他协变量”预期的突变富集区域。

结果1、整个研究框架

分析的“总流程图”。

整个过程：

139,818患者
      ↓
癌症基因组突变
      ↓
HMM
      ↓
显著突变区域
      ↓
173个癌症基因
      ↓
蛋白质结构映射
      ↓
功能结构域
      ↓
三维结构约束
      ↓
临床/多组学
      ↓
突变功能解释

最终发现：

显著突变区域明显富集于功能注释残基。

missense：

p = 2.35 × 10⁻⁴

truncating：

p = 3.88 × 10⁻²

说明这些区域不是随机产生的，而具有明显生物学意义。

显著突变区域与功能结构域的关系

转录因子

不同类型转录因子的突变集中区域不同。

① 细胞谱系特异性转录因子

例如：

• ETV6
• IKZF1
• IRF4
• RUNX1
• FOXA1
• SOX9

突变主要集中在：

DNA-binding domain

也就是说：

突变
 ↓
DNA结合能力改变
 ↓
转录调控改变
 ↓
细胞身份/分化改变

② 应激响应型转录因子

例如：

• NFE2L2
• STAT3
• FOXO1
• SMAD2/3/4

突变更多位于：

regulatory domains

而不是DNA-binding domain。

说明：

癌症可能不是直接破坏DNA结合，而是破坏上游调控、磷酸化、二聚化等过程。

泛素化系统

这是非常有意思的一部分。

例如：

• SPOP
• VHL
• BAP1
• CBL
• FBXW7

它们的突变主要集中在：

substrate-recognition domain

也就是：

底物识别区域。

例如：

正常：

癌蛋白
 ↓
SPOP/FBXW7识别
 ↓
泛素化
 ↓
蛋白降解

突变：

底物识别区域改变
 ↓
癌蛋白不能被正确识别
 ↓
癌蛋白积累
 ↓
肿瘤发生

因此不是简单说：

“SPOP发生突变。”

而是进一步指出：

SPOP的底物识别界面发生突变。

这就是从：

gene-level

进入：

domain-level

再进入：

structure-level

的关键。

染色质调控蛋白

例如：

• DNMT3A
• CREBBP
• EP300
• EZH2
• SETD2

突变主要集中在：

catalytic domains

即：

催化结构域。

这些区域负责：

• DNA methylation
• histone acetylation
• histone methylation
• chromatin remodeling

因此：

Mutation
 ↓
Catalytic domain
 ↓
Enzymatic activity
 ↓
Epigenome
 ↓
Gene expression
 ↓
Tumor phenotype

论文明确发现染色质调控蛋白的显著突变区域主要落在催化结构域。

受体酪氨酸激酶——与EGFR尤其相关

文章分析：

• EGFR
• ERBB2
• FLT3
• MET
• ALK
• FGFR2
• FGFR3
• ERBB3
• KIT
• RET

发现突变集中在：

kinase domain

transmembrane domain

extracellular ligand-binding domain

进一步发现这些突变可能影响：

• ATP-binding pocket
• activation loop
• αC-helix
• autoinhibitory phosphorylation motif
• dimerization site

EGFR突变 → 蛋白结构 → 配体/药物结合 → 分子对接 → MD

不同癌症类型是否有不同突变模式？

分析继续问：

同一个基因，在不同癌症中是不是会攻击不同的位置？

答案：

大部分情况下相对保守，但存在明显癌种特异性。

72.5%的显著突变区域：

348 / 480

在不同癌症类型之间没有显著位置差异。

说明：

很多突变受到共同的蛋白结构和功能约束。

但是有一些非常重要的例外。

EGFR

肺腺癌：

主要是 kinase domain

胶质母细胞瘤：

更多是 extracellular domain

这说明：

同一个EGFR基因，在不同肿瘤中可能通过不同结构机制被激活。

这对精准医学非常重要。

截短突变与NMD

传统上容易认为：

truncating mutation = 整个蛋白被破坏。

但是发现：

截短突变并不是均匀分布在整个基因上。

尤其是抑癌基因。

Tumor suppressor

例如：

• TP53
• CDKN1A
• CDKN2A
• RB1
• PTEN
• VHL
• STK11

其N端和C端某些区域：

很少出现截短突变。

分析认为这与：

Nonsense-mediated decay，NMD

有关。

如果提前终止密码子导致mRNA被NMD降解：

truncating mutation
 ↓
mRNA被NMD
 ↓
蛋白无法产生

但是如果突变位于：

NMD escape region

则：

truncating mutation
 ↓
mRNA仍然存在
 ↓
产生截短蛋白
 ↓
可能仍然具有部分功能

因此癌细胞未必选择这种突变。

但癌基因的情况可能相反

例如：

• CCND1
• CCND2
• CCND3
• PPM1D
• ERBB2
• ERBB3
• FGFR2
• FGFR3
• NOTCH1

截短突变反而可以集中在：

C-terminal region

原因可能是：

C端包含：

• PEST motifs
• ubiquitination sites
• degradation signals

正常：

蛋白
 ↓
C端降解信号
 ↓
泛素化
 ↓
蛋白降解

突变后：

C-terminal truncation
 ↓
去掉degradation motif
 ↓
蛋白稳定性增加
 ↓
癌蛋白积累
 ↓
肿瘤发生

从线性序列进入三维蛋白结构

很多突变在一级序列上看起来分散。

但是放到蛋白质三维结构上：

它们会汇聚到同一个功能表面。

例如：

一级序列：

突变    突变       突变
 ↓       ↓          ↓
───────────────

三维结构：

       ●●●
      ●功能●
       ●●●

三个序列上分散的突变
实际上都位于同一个结合界面

这就是：

proteo-genomics 的核心价值。

突变与三维结构约束

为什么突变集中在这些位置？

主要发现两类模式。

模式A：突变集中在分子相互作用界面

例如：

FBXW7

显著突变区域几乎都对应：

substrate-interaction sites

SPOP

显著突变区域集中在：

substrate-recognition surface

KRAS

突变热点靠近：

GTP ligand

FOXA1

突变区域直接面对：

DNA

也就是说：

突变直接改变“谁和谁结合”。

十七、模式B：突变集中在蛋白核心

典型：

TP53

TP53突变不是主要集中在DNA结合表面，而是：

蛋白内部核心。

说明其机制可能不是：

改变DNA结合特异性

而是：

破坏蛋白质稳定性。

PTEN、CDKN2A、BAP1、STK11

很多抑癌基因也表现出类似模式。

突变集中：

protein core

并影响：

protein stability / ΔΔG

同时还与：

• α-helix
• β-sheet

有关。

因此：

α-helix突变

可能：

影响蛋白相互作用界面。

β-sheet核心突变

更可能：

破坏蛋白稳定性。

区分癌基因和抑癌基因

进一步把结构特征整合起来：

• α-helix
• β-sheet
• loop
• intrinsically disordered region
• surface/core
• solvent accessibility
• ΔΔG
• 3D mutation geometry

结果非常有意思：

结构特征能够区分：

oncogenes vs. tumor suppressors

AUC：

0.856

其中最重要的特征：

这意味着什么？

可以把癌基因突变机制大致理解成：

Oncogene

突变
 ↓
特定结合位点
 ↓
激活
 ↓
信号增强
 ↓
癌基因获得功能

例如：

KRAS、EGFR、PIK3CA

Tumor suppressor

突变
 ↓
蛋白核心/结构域
 ↓
稳定性下降
 ↓
蛋白功能丧失
 ↓
抑癌作用消失

例如：

TP53、PTEN

这就是本文非常重要的：

不同癌基因/抑癌基因的结构性失活模式。

与已知癌基因突变数据库比较

进一步验证：

这些“显著突变区域”是不是真的重要？

使用：

• COSMIC
• CIViC
• ClinVar

作为参考。

结果：

COSMIC

AUC = 0.82

CIViC

AUC = 0.81

ClinVar

AUC = 0.85

而且：

显著突变区域排名前10%的残基，包含了大量数据库已经确认的致癌突变。

COSMIC：

62.4%

CIViC：

57.7%

ClinVar：

70.9%

这说明：

算法能够从没有直接使用这些数据库标签的情况下，重新找到大量已知致癌突变。

与AlphaMissense、CADD、FoldX等方法比较

还比较：

• AlphaMissense
• CADD
• PhyloP
• FoldX
• HotSpot3D
• OncodriveCLUSTL
• ActiveDriver

发现：

传统 pathogenicity score 与本文方法回答的问题不完全相同。

例如：

AlphaMissense

更关注：

“这个突变可能是不是有害？”

而本文：

“这个位置是不是癌症中特别受到选择的区域？”

这是两个不同的问题。

KRAS是一个非常好的例子

KRAS整个GTPase domain都很重要。

因此：

AlphaMissense可能给整个domain较高分。

但癌症中的真正driver mutation：

主要集中在几个hotspot。

例如：

KRAS GTPase domain

|----------------------------|

     ↑       ↑
   hotspot hotspot

所以：

“蛋白功能重要” ≠ “所有位置都同样是癌症driver”。

本文的优势就是识别：

cancer-specific mutation selection。

显著突变区域与基因表达/信号通路

进一步问：

这些区域真的会产生功能后果吗？

他们分析：

• gene expression
• transcription factor activity
• downstream signaling
• clonality
• survival
• treatment response

结果：

显著突变区域相比非显著区域：

基因表达变化更明显

转录因子活性变化更明显

下游信号变化更明显

更可能是早期克隆事件

这非常重要。

因为说明：

SMR不仅仅是统计学上的“突变热点”，而是真正对应肿瘤生物学功能的区域。

临床生存

发现：

significant-region mutation

与：

patient survival

存在不同关联。

也就是说：

同一个基因

Mutation A
↓
significant region
↓
明显临床表型

Mutation B
↓
non-significant region
↓
可能接近未突变患者

这说明：

“有没有突变”可能不是最重要的；“突变在哪里”同样重要。

治疗反应

这一部分尤其值得关注。

例如：

Breast cancer

TP53 significant mutations

↓

与多柔比星治疗后的较差结局相关。

ESR1 significant mutations

↓

与leuprolide治疗的PFS差异相关。

Colorectal cancer

KRAS / FBXW7 significant mutations

↓

5-FU + leucovorin

↓

更差PFS。

NSCLC

KRAS significant mutations

↓

carboplatin + paclitaxel

↓

更差治疗结局。

而：

同一基因中的低显著性突变通常没有表现出类似的治疗反应模式。

因此：

突变位置可能比“基因是否突变”更能预测治疗反应。

临床最有价值的地方——VUS解释

临床基因检测经常遇到：

VUS——Variant of Uncertain Significance

也就是：

这个突变发生了，但是不知道它到底有没有致癌意义。

传统数据库：

• COSMIC
• ClinVar
• CIViC
• OncoKB
• CKB

之间并不是完全一致。

研究发现：

五个数据库中，只有 40.4% 的突变至少被两个独立数据库一致标注。

如果要求更严格的top-tier annotation：

只有 29.6%。

这说明：

大量突变仍然缺乏明确注释。

提出的解决方案

如果一个未知突变：

Mutation X
   ↓
数据库没有明确注释

可以继续看：

Mutation X
 ↓
是否位于Significant Mutated Region？
 ↓
是否靠近功能结构域？
 ↓
是否位于蛋白结合界面？
 ↓
是否位于蛋白核心？
 ↓
是否影响结构稳定性？
 ↓
是否与已知致癌突变空间邻近？

因此：

SMR可以作为VUS临床解释的额外证据。

论文最重要的一个观点

不是说：

“SMR = pathogenic mutation”。

而是：

SMR提供额外的生物学背景，用于优先级排序。

论文明确强调：

这个atlas并不是用来直接给一个突变下最终的功能或临床结论，而是提供标准化背景，用于和已有生物学、临床及专家知识结合。

这个区别非常重要。

Discussion——最终提出什么？

研究认为过去的癌症突变研究主要停留在：

gene level

例如：

TP53 mutated
KRAS mutated
EGFR mutated

而本文推进到：

region level

进一步：

structure level

最后：

mechanism level

也就是：

Gene
 ↓
Mutation
 ↓
Significantly mutated region
 ↓
Functional domain
 ↓
3D structure
 ↓
Interaction surface
 ↓
Molecular mechanism
 ↓
Clinical phenotype

全文最重要的六个发现

发现1：癌症突变不是随机分布的

139,818患者、173癌症基因中，大量突变形成：

Significantly Mutated Regions

发现2：显著突变区域对应功能结构域

例如：

发现3：三维结构可以解释很多突变

突变可能集中在：

• protein core
• DNA interface
• ligand-binding site
• protein-protein interface
• GTP-binding site

发现4：癌基因和抑癌基因的结构机制不同

癌基因：

更倾向于特定结合界面、调控表面和激活位点。

抑癌基因：

更倾向于结构核心、α-helix、β-sheet和蛋白稳定性。

发现5：突变位置影响临床表型

显著区域突变与：

• gene expression
• TF activity
• signaling
• clonality
• survival
• treatment response

相关。

发现6：可以辅助VUS解释

对于数据库没有充分注释的突变：

如果它位于SMR，同时处于关键结构域/结构界面，那么可以提高其进一步功能验证的优先级。

但不能直接把它定义为致病突变。

把整篇文章浓缩成一张“科研流程图”

这篇文章实际上可以浓缩成：

癌症基因组
            │
            ↓
      139,818 patients
            │
            ↓
      Somatic mutations
            │
            ↓
     ┌──────────────┐
     │ HMM模型       │
     │ 背景突变率     │
     │ nucleotide     │
     │ context        │
     │ AlphaMissense  │
     └──────────────┘
            │
            ↓
 Significant Mutated Regions
            │
            ↓
 ┌──────────────────────────┐
 │       蛋白质结构          │
 │                          │
 │ functional domains       │
 │ α-helix / β-sheet        │
 │ core / surface           │
 │ ligand binding           │
 │ protein interface        │
 │ DNA interface            │
 │ ΔΔG                      │
 └──────────────────────────┘
            │
            ↓
      机制解释
            │
      ┌─────┼─────┐
      ↓     ↓     ↓
  激活    稳定性  相互作用
  ↓       ↓       ↓
Oncogene  TSG     signaling
            │
            ↓
       多组学验证
            │
      ┌─────┼─────┐
      ↓     ↓     ↓
  RNA/protein  clonality
      │
      ↓
     临床
      │
 ┌────┼─────┐
 ↓    ↓     ↓
生存  治疗反应  VUS解释

与“基因组突变→空间→结构→对接→MD”的关系

基因组突变 → 蛋白结构 → 功能机制

癌症基因组/WES/WGS
        ↓
体细胞突变
        ↓
Significant Mutated Region
        ↓
单细胞/空间转录组
        ↓
确定突变发生在哪类肿瘤细胞/空间区域
        ↓
WT vs Mut蛋白结构
        ↓
结构差异
        ↓
候选药物/配体
        ↓
Molecular Docking
        ↓
PyRosetta局部优化
        ↓
GROMACS Molecular Dynamics
        ↓
RMSD / RMSF / Rg
H-bond / SASA
MM/PBSA
        ↓
突变对药物结合的影响
        ↓
耐药/敏感机制

最后总结

癌症基因组学告诉我们“哪里发生了突变”，而蛋白质结构告诉我们“这些突变为什么发生在这里、可能改变什么功能”。

利用 139,818名患者、173个癌症基因、18+癌种建立显著突变区域图谱，把癌症突变从传统的“基因层面”推进到了“区域—结构—功能—临床”层面。这些区域往往对应DNA结合位点、配体结合位点、催化结构域、底物识别界面、蛋白核心以及降解信号等关键结构；同时能够解释不同癌基因/抑癌基因的不同失活机制，并辅助解释数据库中注释不足的突变。

生活很好，有你更好。