分子动力学Gromacs--运输醌的蛋白丝扩大革兰阳性 Bacillota 细菌的生物能量容量

作者，Evil Genius

无论做什么事情，我们先把事情做好，再说其他的内容，我认为这个内容非常重要，即使只有一个人参加培训，我也想好好全流程梳理一下，根本出发点就是想把这个组学搞明白。

之前有同事问我磷脂双分子层与蛋白的结合模式，采用分子动力学模拟一下，我当时真的不会；后面又有人我问我药物投送到细胞内穿过细胞膜或者作用于膜表面蛋白的动力学模式，当时的我还是不会，但是确实感觉到这个方向与我们的研究息息相关。

今日参考文献

一、这篇文章到底发现了什么？

先用一句话概括：

Bacillus subtilis 的 Ndh 和 Ncp 蛋白能够组装成一种类似“人工膜”的蛋白质-脂质管道，把细胞膜里的呼吸醌（menaquinone，MK）运输到远离细胞膜的位置，从而让细菌在有限的膜面积下获得更多的呼吸能力。

论文发现：

Ndh + Ncp → 4:4复合物 → 蛋白丝 → 内部疏水腔 → 装载磷脂和醌 → 醌可以在其中运输 → Ndh利用NADH还原醌 → 扩大呼吸能力。

这个结构非常有意思，因为它实际上解决了一个非常基本的问题：

细菌的“膜面积”有限

呼吸链中的：

NADH → NADH dehydrogenase → Quinone → terminal oxidase → ATP

很多步骤都发生在膜附近。

但是革兰阳性细菌只有一层主要细胞膜，没有像真核细胞那样：

• 线粒体
• 线粒体嵴
• 叶绿体
• 大量内部膜系统

所以：

膜面积 = 呼吸链可以容纳多少电子传递机器的限制因素。

论文发现，B. subtilis 不一定非要增加膜面积。

它采取了另外一种方式：

把“膜的功能”搬到蛋白质内部。

也就是：

Ndh–Ncp filament ≈ pseudomembrane（假膜）

摘要明确指出，Ndh和Ncp形成4:4复合物，内部有被溶剂排除的疏水腔，其中含有磷脂并可以储存醌；多个复合物进一步首尾连接形成连续管道。

二、论文整体逻辑

文章其实可以理解成下面这条证据链：

① Ndh 和 Ncp 是否真的有功能关系？
              ↓
② 它们是否形成稳定复合物？
              ↓
③ 复合物是什么结构？
              ↓
④ 为什么能够运输疏水性的quinone？
              ↓
⑤ 内部是不是有lipid？
              ↓
⑥ quinone能不能进入这个结构？
              ↓
⑦ MD能不能解释lipid和膜如何进入？
              ↓
⑧ quinone是否真的能够完成电子传递？
              ↓
⑨ 这种机制是否广泛存在？
              ↓
⑩ 最终提出Ndh–Ncp工作的模型

三、Introduction：研究这个问题的意义

细胞呼吸需要把电子传递给膜中的疏水性醌。

而醌位于：

lipid bilayer

里面。

所以呼吸链酶要想获得足够的醌，就必须靠近膜。

传统NDH-2：

NADH
 ↓
NDH-2
 ↓
Quinone
 ↓
Respiratory chain

NDH-2通常直接靠近膜。

问题是：

膜空间是有限的。

特别是快速生长的时候，大量：

• 营养物运输
• 细胞壁合成
• 分泌
• 呼吸链

都需要使用膜。

因此提出：

有没有一种方法，可以让呼吸链不完全依赖膜面积？

这就是整篇文章的核心科学问题。

四、首先证明 Ndh–Ncp 是一个真正的功能性复合物

敲除实验

构建：

• WT
• Δndh
• Δncp

结果：

Δndh和Δncp都出现生长缺陷。

也就是说：

Ndh和Ncp缺失产生类似表型。

这提示：

Ndh和Ncp可能在同一个功能通路中。

UV-visible spectroscopy

检测Ndh–Ncp中的FAD。

加入NADH之后出现：

~660 nm charge-transfer complex，CTC

说明：

NADH可以和Ndh中的FAD发生电子转移相关作用。

也就是说这个蛋白复合物确实具备NADH氧化能力。

五、动力学

这是一个非常重要的生化实验。

作者测：

NADH oxidation

得到：

Km ≈ 50 μM Vmax ≈ 110 s⁻¹

使用MDA作为电子受体。

而使用DQ时Vmax降低。

作者因此推测：

Ndh–Ncp可能更偏好menaquinone，而不是ubiquinone。

六、真正的结构大发现

这里开始进入结构生物学。

作者首先用：

negative-stain EM

看到：

Ndh–Ncp形成filaments。

甚至最多可以看到：

13个重复单元。

然后使用：

cryo-EM

得到单个Ndh–Ncp：

2.11 Å

并发现：

Ndh4:Ncp4 = 4:4

结构可以简单画成：

Ndh
        ↓
    ┌───────┐
 Ndh│       │Ndh
    │  Ncp  │
 Ndh│  tube │
    └───────┘

      ↓

Ndh–Ncp unit

      ↓ 首尾连接

[Ndh–Ncp]-[Ndh–Ncp]-[Ndh–Ncp]-[Ndh–Ncp]

所以：

Ncp

实际上是一个：

hollow tetrameric tube

而Ndh：

围绕Ncp管道排列。

七、为什么这些复合物可以连接起来？

这是结构非常漂亮的地方。

一个Ndh–Ncp单元：

Head → Tail

下一个：

Head → Tail

通过：

• Phe108
• Lys115
• Asp21

形成连接。

特别是：

Phe108插入另一个Ncp单元

以及：

Lys115–Asp21盐桥

共同帮助形成filament。

进一步通过突变验证：

破坏这些关键残基 → filament形成能力下降。

所以完成了第一条证据链：

Ndh + Ncp → 稳定复合物 → 4:4 → filament

八、这个“管道”为什么能够运输quinone？

这是全文第二个关键。

Quinone非常疏水。

所以分析发现Ndh–Ncp内部不是普通水环境，而是：

hydrophobic lumen

即：

疏水性内部腔道。

tube + chamber

内部主要由疏水氨基酸组成。

因此可以理解成：

细胞膜
│
│ Quinone
↓
┌───────────────┐
│ hydrophobic   │
│ Ncp tube      │
│               │
│   Quinone     │
│               │
└───────┬───────┘
        ↓
       Ndh

这非常关键。

因为：

Quinone不喜欢水。

但是：

喜欢脂质环境。

所以Ndh–Ncp内部实际上创造了一个：

“类似膜的疏水环境”

九、Ncp如何连接真正的细胞膜？

这里有三个关键残基：

• Phe108
• Arg112
• Lys115

其中：

Phe108

疏水性很强。

可以插入lipid bilayer。

而：

Arg112 / Lys115

可以与带负电的磷脂头基相互作用。

所以：

Ncp
           │
      Phe108 ↓
       ┌───────┐
       │       │
───────┼───────┼────── lipid bilayer
       │       │

作者认为Ncp头部既参与：

membrane interaction

又参与：

filament formation

所以这是一个“双功能区域”。

十、最重要的发现之一——里面真的有脂质

Cryo-EM里面发现了一些额外density。

这些density：

• 化学环境符合lipid
• 位于Ndh和Ncp之间
• phosphate head group朝外
• lipid tail朝内部

作者认为主要是：

• PE
• PG

因此：

Ndh–Ncp不是单纯的蛋白质管道。

而是：

Protein + Lipid hybrid structure

十一、Ndh到底抓什么？

第三部分非常关键，因为这里把：

结构 + NADH + FAD + Quinone

串起来。

作者加入NADH后进行cryo-EM。

获得：

2.52 Å

的NADH-bound structure。

发现：

FAD

NADH

Quinone

都有清晰density。

十二、NADH如何结合？

Ndh是一个：

NDH-2

类型的NADH dehydrogenase。

NADH结合位点存在保守：

WxxG motif

其中包括：

• Trp254
• Gly257

以及：

• Ile116
• Gly163
• Val196–Gly199
• Val231
• Pro309
• Thr310

这些残基共同形成NADH结合环境。

十三、MK-8在哪里？

这是整篇结构机制的核心之一。

作者发现quinone结合在：

Ndh electron acceptor site

并且：

MK-8 binding site朝向Ndh–Ncp内部tube。

也就是说：

Quinone不是从蛋白外面的水溶液直接进入Ndh。

而是：

膜
 ↓
Ncp hydrophobic chamber
 ↓
Ndh–Ncp内部
 ↓
Ndh quinone binding site
 ↓
MK reduction

这就是所谓：

quinone-transporting filament

十四、Lipidomics

接下来作者问：

既然结构里有lipid，那到底是什么？

做：

Lipidomics

发现：

• PE
• PG

大量存在。

同时还有：

• UQ-8
• MK-8
• DMK-8

而且Ndh–Ncp中的：

quinone / phospholipid ratio

高于普通E. coli membrane。

说明：

Ndh–Ncp具有浓缩quinone的能力。

十五、更加关键——它真的可以从膜里面“拿走”MK

作者把纯化的Ndh–Ncp：

与B. subtilis membrane一起孵育。

B. subtilis主要使用：

MK-7

结果：

Ndh–Ncp中的MK-7增加约90倍。

这说明：

Ndh–Ncp可以从真正的细胞膜中富集/提取menaquinone。

所以整个故事从“结构推测”变成了：

结构 + lipidomics + functional experiment

共同支持。

十六、本文的 GROMACS / MD 图

GROMACS分子动力学经典使用案例

而且它不是：

“为了画一张好看的MD图而做MD。”

而是：

Cryo-EM无法直接确定脂质在内部的精确位置 → MD用来补充结构信息。

这是MD非常正确的使用方式。

cryo-EM density不足以解析phospholipid的位置，因此进行MD simulation。

十七、MD系统怎么建立？

建立：

Protein

Ndh–Ncp

Lipids

• PE
• PG

Quinone

• MK-7

Membrane

PE/PG lipid bilayer

也就是说系统是：

Ndh–Ncp
    +
PE/PG
    +
MK-7
    +
PE/PG bilayer
    ↓
MD simulation

这就是一个典型的：

membrane protein–lipid–small molecule MD system

还进行了大量optimization simulation，用来确定：

lipid数量和初始位置。

最终这个巨大的腔室可以容纳：

39个phospholipids

十八、MD和Cryo-EM进行交叉验证

并不是说

“MD预测了一个结构，所以我们认为它是真的。”

而是：

Cryo-EM

看到：

lipid density

↓

MD

预测：

PE/PG应该位于什么位置

↓

两者吻合

所以作者认为：

MD model提供了合理的结构解释。

这就是：

Experimental structure + MD simulation

最经典的组合方式。

十九、脂质在里面是什么姿态？

MD发现：

phospholipid head group

朝向外部水环境。

lipid tail

朝向Ndh–Ncp内部疏水腔。

即：

水相
 ↓
PO4 head
   │
   │
lipid tail
   ↓
████████████
hydrophobic lumen
████████████

这个结果非常符合物理化学规律。

因为：

phosphate head喜欢水。

而：

hydrocarbon tail喜欢疏水环境。

所以这个结构从MD角度非常合理。

二十、MD解释Ncp如何插入细胞膜

MD显示：

Phe108

插入bilayer。

Arg112 / Lys115

与phospholipid headgroup相互作用。

而且Ndh–Ncp会发生一定程度的：

tilt

也就是：

整体倾斜进入膜。

最终形成：

Ndh
         │
      Ncp tube
         │
         ↓
==================
   lipid bilayer
==================
         ↑
      Quinone
         ↓
    Ncp lumen

更加重要的是：

膜中的lipid tail可以进入Ncp tube。

于是：

membrane hydrophobic lumen

和

Ndh–Ncp hydrophobic lumen

连接起来。

这意味着：

Quinone可以从membrane → Ncp → Ndh之间扩散。

二十一、所以第四部分真正回答了什么？

不是单纯回答：

“lipid在哪里？”

而是在回答：

Ndh–Ncp究竟如何从细胞膜获得quinone？

模型是：

NADH
               ↓
             Ndh
               ↓
          MK-7 reduction
               ↑
               │
        Ncp hydrophobic tube
               ↑
               │
       MK-7 diffusion
               ↑
               │
        lipid bilayer

也就是：

膜和Ndh–Ncp内部形成连续疏水通道。

二十二、MD之后还有一个重要的功能验证

又用了：

Cyclic voltammetry

验证电子转移。

结果显示：

加入NADH以后：

出现catalytic oxidative current。

而且MK-7参与这个电子传递过程。

所以这里又形成：

MD
 ↓
解释结构
 ↓
quinone能够移动
 ↓
electrochemistry
 ↓
证明quinone参与电子转移

这就是非常完整的结构机制研究。

二十三、这个东西不是B. subtilis的“偶然现象”

进一步进行：

phylogenetic analysis

分析：

113,104个archaeal/bacterial genomes。

发现Ndh–Ncp主要存在于：

Bacillota

而且：

684个物种

编码Ndh–Ncp。

所以不是：

Bacillus subtilis独有。

而是：

Bacillota中比较广泛存在的一种生物能量策略。

二十四、进化树

主要把NDH-2分成：

• Clade A
• Clade B
• Clade C1
• Clade C2
• Clade D
• Clade E

其中最重要：

Clade C1 = Ndh–Ncp

C2可能代表一个：

transitional state

即：

传统NDH-2
   ↓
获得DUF1641/Ncp
   ↓
形成初步相互作用
   ↓
Ndh–Ncp complex
   ↓
进一步进化
   ↓
Ndh–Ncp filament

二十五、结构预测

还使用：

Chai1

预测不同NDH-2 clade的结构。

包括：

• B. subtilis Ndh
• YumB
• YutJ
• 其他Bacillota NDH-2

并比较它们的：

membrane interaction region。

这部分和：

AlphaFold3 / AI蛋白结构预测

也直接相关。

论文方法中明确写到结构建模使用：

Chai1 或 AlphaFold3

并提供NADH/FAD/MK-7/MK-8/UQ-8等配体信息。

二十六、全文最终模型

第六部分是整篇文章的“总结图”。

作者提出三个状态。

Fig. 6a：Ndh–Ncp靠近膜

Membrane
════════════════

MK-7
 ↓
Ncp
 ↓
Ndh
 ↓
NADH → NAD+

Ncp从膜中获取MK-7。

然后：

Ndh利用NADH还原MK-7。

Fig. 6b：Ndh–Ncp可以离开膜

也就是说：

它不一定永久固定在膜上。

Ncp里面已经储存了一些MK-7。

因此：

Membrane
    ↓
Ndh–Ncp
    ↓
dissociation
    ↓
still has quinone

这就是作者提出的：

quinone battery

概念。

二十七、Fig. 6c：多个Ndh–Ncp串起来

最终：

Membrane
══════════════════
      ↓
    MK-7
      ↓
┌────────┐
│ Ncp    │
│ Ndh    │
└────────┘
      ↓
┌────────┐
│ Ncp    │
│ Ndh    │
└────────┘
      ↓
┌────────┐
│ Ncp    │
│ Ndh    │
└────────┘

多个Ndh–Ncp：

首尾相连

形成：

quinone-transporting filament

MK-7可以沿着连续的Ncp tube移动。

二十八、这篇文章最核心的机制

全文浓缩成下面这张逻辑图：

NADH
                      │
                      ↓
                 ┌─────────┐
                 │   Ndh   │
                 │  FAD    │
                 └────┬────┘
                      │
                MK-7 reduction
                      ↑
                      │
             hydrophobic lumen
                      │
       ┌──────────────┴──────────────┐
       │            Ncp              │
       │                             │
       │     PE / PG + MK-7          │
       │                             │
       └──────────────┬──────────────┘
                      │
                membrane
══════════════════════════════════
                ↑
               MK-7

然后：

一个Ndh–Ncp
       ↓
多个Ndh–Ncp首尾相连
       ↓
filament
       ↓
continuous hydrophobic conduit
       ↓
更多Ndh可以利用MK
       ↓
更高的respiratory capacity

文章认为，一个最多13个单元的filament理论上可以容纳：

52个Ndh subunits

而其膜占用面积可以接近一个膜内NDH-2二聚体的尺度。

最后，里看看方法

生活很好，有你更好。