课前准备--蛋白-蛋白分子对接（二）

原创

追风少年i

修改于 2026-08-19 09:14:32

1150

作者，Evil Genius

今天我们更新一下蛋白-蛋白分子对接

其实别以为这样的内容离我们很远，其实很近，我们日常使用的注射制剂，很多都是蛋白制剂，都是通过算法 + 临床得来的，其实蛋白蛋白分子对接常用的就是抗原抗体，由此还形成了一个很大的学科，那就是蛋白设计，根据靶向蛋白分子，独立设计蛋白抗体，并且加上一些特殊的结构，达到治疗的目的。

先来看看蛋白蛋白相互作用。

生物体的生理功能主要由细胞中的蛋白质控制和调节。其中，多数蛋白质是作为蛋白质复合物中的一部分参与细胞的代谢过程。因此，研究蛋白质间的相互作用是理解生命活动的基础。

通常来讲，蛋白蛋白分子对接的方法ZDOCK的运用最多，这列给大家一个蛋白结构，大家可以跟着做一下：

从PDB数据库下载得到2019-nCoV的spike蛋白6VXX和ACE2蛋白晶体结构1R42，模拟它们的相互作用

在Pymol软件中准备蛋白1R42和6VXX，spike蛋白6VXX为多聚体，只保留B链，优化后分别输出文件1r42_minimize.pdb和6vxx_minimize.pdb

例如文献中的运用

一、先理解：ZDOCK到底在做什么？

假设我们有：

蛋白 A：PD-1
蛋白 B：PD-L1

我们希望得到：

PD-1 + PD-L1 → 最可能的结合复合物结构

ZDOCK的基本思想是：

PD-1结构
   +
PD-L1结构
   ↓
ZDOCK刚性蛋白-蛋白对接
   ↓
产生大量候选复合物
   ↓
打分
   ↓
得到Top 10 / Top 20 / Top 100
   ↓
聚类
   ↓
人工分析结合界面
   ↓
得到候选PD-1/PD-L1复合物

和你之前做的 AutoDock Vina小分子对接相比，最大的区别是：

	Vina	ZDOCK
对接对象	蛋白-小分子	蛋白-蛋白
配体	小分子	另一个蛋白
搜索空间	蛋白口袋	整个蛋白表面
柔性	有限	经典ZDOCK主要是刚性对接
输出	ligand poses	protein-protein complexes
核心问题	小分子如何进入口袋	两个蛋白如何贴合

二、实际案例：PD-1–PD-L1

我们假设：

Receptor：PD-1

Ligand：PD-L1

目标：

预测PD-1与PD-L1形成复合物时，两者的空间结合方式。

结构可以从 Protein Data Bank 获取。

例如可以搜索：

PD-1 PD-L1 complex PDB

经典PD-1/PD-L1复合物结构可以作为最终验证的参考结构。

这里有一个非常重要的实验设计思想：

不要直接拿完整PD-1/PD-L1复合物做ZDOCK

如果目标是测试ZDOCK预测能力，应该：

已知PD-1/PD-L1复合物
        ↓
拆开
        ↓
PD-1单体
+
PD-L1单体
        ↓
ZDOCK
        ↓
预测复合物
        ↓
与原始实验复合物比较

这叫做 docking re-docking / blind docking validation。

三、第一步：下载两个蛋白结构

例如得到：

PD1.pdb
PDL1.pdb

此时不要急着ZDOCK。

先检查PDB。

可以使用：

PyMOL
ChimeraX
Chimera
PDBFixer

例如PyMOL：

pymol PD1.pdb

观察：

PD-1
 ├── Chain A
 ├── ligand？
 ├── water？
 ├── antibody？
 └── other chains？

四、为什么PDB不能直接扔进ZDOCK？

这是蛋白对接最容易出问题的地方之一。

实验结构PDB往往不是：

一个干净的蛋白

而可能是：

Protein
+
Water
+
Ion
+
Ligand
+
Antibody
+
多个Chain
+
晶体添加剂

例如：

ATOM
ATOM
ATOM
HETATM ← ligand
HETATM ← water
ATOM
ATOM

ZDOCK真正需要的是：

纯蛋白结构

所以需要预处理。

五、第二步：清理PDB

例如PD-1：

PD1_original.pdb

处理以后：

PD1_clean.pdb

PD-L1：

PDL1_original.pdb
        ↓
PDL1_clean.pdb

通常需要处理：

1. 删除水

例如：

HOH

删除。

2. 删除无关配体

如果PDB里面存在：

HETATM

要判断是不是需要保留。

对于普通蛋白-蛋白对接，一般删除无关小分子。

3. 保留正确的蛋白链

例如：

PD-1:
Chain A

PD-L1:
Chain B

最后最好得到：

PD1_clean.pdb
PDL1_clean.pdb

六、第三步：检查缺失残基

这是非常重要的一步。

比如PDB可能是：

1 2 3 4 5 6 7
A B C D E F G

但实际上：

1 2 3 5 6 7
A B C   E F G

Residue 4缺失。

对于蛋白表面正好参与结合的位置，这可能严重影响对接。

可以使用：

PDBFixer
Modeller
ChimeraX
AlphaFold预测结构

补全。

七、第四步：准备ZDOCK输入

ZDOCK本质上需要两个蛋白：

Receptor
Ligand

例如：

Receptor = PD1_clean.pdb

Ligand = PDL1_clean.pdb

这里的“ligand”不是小分子意义上的ligand。

而是：

参与蛋白-蛋白对接的第二个蛋白。

八、ZDOCK的核心算法

ZDOCK不是简单地：

“把PD-L1放到PD-1表面随机旋转。”

它会进行大量空间搜索。

可以粗略理解成：

PD-L1
  ↓
旋转
↙ ↓ ↘
多个方向
  ↓
平移
  ↓
与PD-1碰撞检测
  ↓
计算score

数学上可以简单理解为：

不同版本/模式的具体打分组成有所不同。

其中最重要的几个概念：

Shape complementarity

两个蛋白表面是否互补。

类似：

蛋白A：

     /\__
 ___/    \___

蛋白B：

 ___      ___
    \____/

如果：

凸 → 凹
凹 → 凸

匹配得比较好。

Electrostatics

例如：

PD-1表面：++++
PD-L1表面：----

静电吸引有利。

反之：

++++
++++

通常不利。

九、第五步：开始ZDOCK

ZDOCK命令根据你安装的具体版本略有不同。

典型流程类似：

zdock -R PD1_clean.pdb -L PDL1_clean.pdb

或者使用ZDOCK提供的图形界面进行：

Receptor → PD1_clean.pdb
Ligand   → PDL1_clean.pdb

然后：

Run ZDOCK

十、ZDOCK到底产生多少结果？

假设：

ZDOCK
↓
2000 poses

也就是说：

Pose 1
Pose 2
Pose 3
...
Pose 2000

这些全部都是：

PD-1 + PD-L1的不同空间排列。

例如：

Pose 1

       PD-L1
      ███████
    ███████████
        │
        │
     ███████
    PD-1


Pose 2

███████
████████
     ███████
       ███████
          ███


Pose 3

       █████
     █████████
████████
██████

当然真实结构是三维的。

十一、这里千万不要犯一个错误

很多初学者会认为：

ZDOCK排名第一 = 正确答案。

不一定。

这是蛋白-蛋白对接非常重要的一点。

例如：

ZDOCK Rank 1
score = 1785

Rank 2
score = 1779

Rank 3
score = 1768

Rank 4
score = 1759

并不能简单认为：

Rank 1 = 正确

原因是：

蛋白-蛋白对接存在大量局部最优解。

所以后面必须：

聚类 + 界面分析 + 生物学信息 + 结构评价

十二、第六步：对ZDOCK结果进行聚类

假设ZDOCK产生：

2000 poses

很多pose实际上非常相似。

例如：

Pose 1
Pose 8
Pose 13
Pose 27
Pose 43
Pose 87

它们可能都属于同一个结合模式：

Cluster 1

另外：

Pose 2
Pose 9
Pose 18
Pose 25

属于：

Cluster 2

所以：

2000 poses
        ↓
聚类
        ↓
Cluster 1
Cluster 2
Cluster 3
...

这一步非常重要。

因为：

一个稳定出现的大cluster，往往比单独一个高分pose更值得关注。

十三、为什么要看Cluster？

举一个极端例子。

模式A

Pose数量：

Cluster A = 320
Cluster B = 15
Cluster C = 8

模式B

最高score：
Cluster B中的某一个pose

虽然：

Cluster B

有一个最高分，但：

Cluster A

有大量相似结构。

这说明：

A可能是一个更稳定的结合模式。

所以ZDOCK结果不能只看：

score

而应该综合：

score
+
cluster size
+
interface
+
biological information

十四、第七步：用PyMOL查看ZDOCK结果

假设得到：

complex1.pdb
complex2.pdb
complex3.pdb

打开：

pymol complex1.pdb

然后：

PD-1
PD-L1

分别设置不同representation。

例如：

PD-1 → cartoon
PD-L1 → cartoon

然后查看interface。

你会看到：

       PD-L1
    █████████
   ███████████
       ||
       || interface
       ||
    █████████
      PD-1

十五、第八步：重点分析Interface

这一步实际上比“看ZDOCK分数”更重要。

我们需要问：

PD-1和PD-L1到底哪些氨基酸发生了相互作用？

例如：

PD-1

Residue 50
Residue 53
Residue 56
Residue 58

        ↓

PD-L1

Residue 115
Residue 118
Residue 120
Residue 123

可以分析：

1. Hydrogen bonds

PD1 residue
     |
     | H-bond
     |
PDL1 residue

2. Salt bridges

例如：

Lys(+)
   |
   |
Asp(-)

3. Hydrophobic interaction

例如：

Leu
Ile
Val
Phe
Trp

形成疏水核心。

十六、可以进一步计算interface ΔG

例如使用：

Rosetta

或者：

PRODIGY
PISA
FoldX
Rosetta

来分析。

例如：

PD-1 + PD-L1

ΔGbinding = -12.4 kcal/mol

通常：

ΔG越负，预测结合越有利。

但注意：

不能简单把不同软件的ΔG直接横向比较。

十七、实际研究中我更推荐的流程

如果你不是为了学习，而是准备真正用于科研，我建议：

             PDB
              ↓
       蛋白结构预处理
              ↓
      ┌───────┴────────┐
      ↓                ↓
   Protein A         Protein B
      ↓                ↓
  去水/配体          去水/配体
      ↓                ↓
  补缺失残基         补缺失残基
      └───────┬────────┘
              ↓
            ZDOCK
              ↓
        2000 docking poses
              ↓
           Clustering
              ↓
       Top 10–20 clusters
              ↓
         界面分析
              ↓
       ┌──────┴──────┐
       ↓             ↓
  生物学信息       结构评分
       ↓             ↓
       └──────┬──────┘
              ↓
       Top 1–5 complexes
              ↓
          Rosetta优化
              ↓
       Molecular Dynamics
              ↓
       RMSD/RMSF/Rg
       H-bond/SASA
       MM/PBSA或MM/GBSA
              ↓
       最终候选复合物

十八、如果进一步结合你之前学习的PyRosetta

这个就非常有意思了。

你之前问过：

Vina对接以后为什么要用PyRosetta优化？

蛋白-蛋白对接也存在类似的问题。

ZDOCK本质上属于：

刚性对接

也就是：

PD-1结构不变
PD-L1结构不变

但是现实中的蛋白：

PD-1
 ↓
侧链可以转动
backbone也可能发生轻微变化

PD-L1
 ↓
侧链可以转动
backbone也可能发生轻微变化

所以ZDOCK得到的：

Rigid docking

可以继续：

ZDOCK
 ↓
PyRosetta local refinement
 ↓
Side-chain repacking
 ↓
Minimization
 ↓
Interface optimization

十九、ZDOCK + PyRosetta的完整思路

例如：

ZDOCK预测：

PD-1
████████
   ↓
████████ PD-L1

发现interface：

PD1-A52
PD1-Y56
PD1-M64

PDL1-L115
PDL1-F118
PDL1-Y123

然后PyRosetta进行：

① Side-chain repacking

重新寻找：

Rotamer

例如：

Tyr
 ↓
rotamer 1
rotamer 2
rotamer 3
rotamer 4

寻找更合适的侧链构象。

② Energy minimization

优化：

bond
angle
torsion
van der Waals
electrostatics

使interface更加合理。

③ Interface scoring

例如：

Before:

interface energy
= -25 REU

After:

interface energy
= -39 REU

说明局部优化后interface更加有利。

二十、再进一步做MD

如果你想做得更加完整：

ZDOCK
 ↓
Top 10 complexes
 ↓
PyRosetta refinement
 ↓
Top 3
 ↓
GROMACS
 ↓
100 ns MD

然后分析：

RMSD
RMSF
Radius of gyration
SASA
Hydrogen bonds
Salt bridges
Protein-protein contacts
MM/PBSA

例如：

             ZDOCK
                ↓
          2000 poses
                ↓
          Cluster分析
                ↓
          Top 10 poses
                ↓
        PyRosetta refinement
                ↓
            Top 3
                ↓
          100 ns MD
       ┌────────┼────────┐
       ↓        ↓        ↓
     RMSD      H-bond   MM/PBSA
       ↓        ↓        ↓
          最终候选模型

二十一、特别重要：如果已知结合位点，千万不要盲目Blind Docking

假如你已经知道：

PD-1的binding residues：
A50
Y56
M64

那么可以把这些信息加入对接约束。

因为：

Blind docking

整个蛋白表面
       ↓
寻找结合位置

计算空间非常大。

而：

Site-directed docking

PD-1
 ↓
指定binding region

PD-L1
 ↓
指定binding region

搜索空间明显缩小。

二十二、如果是抗体–抗原，更应该这样做

比如：

抗体
  +
HER2

如果已知：

CDR

那么应该重点关注：

CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3

而不是让抗体整个表面都参与随机对接。

流程：

Antibody
   +
Antigen
   ↓
ZDOCK
   ↓
Interface constraint
   ↓
Cluster
   ↓
CDR interface
   ↓
PyRosetta refinement

二十三、你需要特别理解ZDOCK和Vina的区别

你前面已经在学习Vina，这两个可以放在一起理解：

             分子对接
                │
       ┌────────┴────────┐
       │                 │
   小分子-蛋白         蛋白-蛋白
       │                 │
      Vina              ZDOCK
       │                 │
   ligand docking    protein docking
       │                 │
       ↓                 ↓
  binding pocket     protein interface
       │                 │
       ↓                 ↓
  PyRosetta          PyRosetta
       │                 │
       ↓                 ↓
       MD                MD

所以：

Vina解决的是“小分子怎么结合蛋白”，ZDOCK解决的是“两个蛋白怎么结合”。

二十四、如果你准备真正跑一次ZDOCK

建议不要一开始就拿自己的课题蛋白。

可以先做这个练习：

练习项目

PD-1 + PD-L1

完整跑：

1. 下载PDB
       ↓
2. 拆分两个蛋白
       ↓
3. 清理PDB
       ↓
4. ZDOCK
       ↓
5. 得到2000 poses
       ↓
6. Clustering
       ↓
7. 选Top 10
       ↓
8. PyMOL观察
       ↓
9. Interface分析
       ↓
10. 与实验PDB比较
       ↓
11. 计算RMSD
       ↓
12. 判断ZDOCK是否成功预测

其中最后一步特别关键：

假设实验结构是：

Experimental complex

ZDOCK预测：

Docking model

计算：

例如：

RMSD = 2.1 Å

那么说明预测结构和实验结构非常接近。

如果：

RMSD = 15 Å

则说明这个pose很可能不是正确的结合模式。

最后给一个科研上最实用的判断框架

以后你拿到ZDOCK结果，不要只问：

“哪个score最高？”

而应该依次问：

① ZDOCK score怎么样？
        ↓
② 是否属于大cluster？
        ↓
③ interface面积是否合理？
        ↓
④ 有没有明显clash？
        ↓
⑤ 是否形成合理H-bond / salt bridge？
        ↓
⑥ 是否符合已知binding site？
        ↓
⑦ PyRosetta优化后是否稳定？
        ↓
⑧ MD过程中interface是否稳定？
        ↓
⑨ MM/PBSA或MM/GBSA是否支持？
        ↓
⑩ 是否与实验结构/突变数据一致？

这才是一个完整的蛋白–蛋白分子对接分析，而不是简单地“跑一次ZDOCK”。

生活很好，有你更好。

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