分子动力学（cell）--靶向CCKBR通路的选择性偏向性激动策略在阿尔茨海默病治疗中的机制研究

作者，Evil Genius

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今日参考文献

知识积累

表达于内嗅皮层（entorhinal cortex, EC）中的胆囊收缩素B型受体（cholecystokinin B receptor, CCKBR）在记忆和学习过程中发挥重要作用。本研究发现，与CCKBR-Gi信号通路不同，CCKBR-Gs和CCKBR-Gq信号通路对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的治疗具有积极作用。

在临床研究中，发现，AD病情越严重的患者，其CCKBR-Gq信号活性越低。通过冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技术，本研究解析了CCKBR与内源性激动剂硫酸化胆囊收缩素八肽（sulfated CCK8, CCK8s）以及3种不同G蛋白亚型复合物的结构，揭示了受体不同构象状态如何决定其对特定G蛋白的选择性偏向（G protein bias）。

基于这些结构信息，理性设计并开发了多种CCKBR合成偏向性激动剂（synthetic biased agonists），其中包括：

Gi偏向性激动剂（Gi-biased agonist）——z-44

Gq偏向性激动剂（Gq-biased agonist）——3r1

值得注意的是，3r1表现出了显著的治疗潜力：

在5×FAD阿尔茨海默病小鼠模型中改善了认知功能下降；

减少了脑内β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）斑块数量；

通过上调：

α-分泌酶ADAM10（α-secretase）

钙信号分子PLCB4（phospholipase C beta 4）

促进了长时程增强（long-term potentiation, LTP），从而增强突触可塑性和学习记忆能力。

学习（learning，指获取知识的过程）和记忆（memory，指保持信息的能力）是人脑的两项基本功能，它们受到特定脑区中神经递质/神经肽信号通路的调控。神经递质或神经肽的减少，以及其受体表达水平下降，尤其是在老年人群中，可能导致记忆功能障碍。

胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）是大脑中含量最丰富的神经肽之一，广泛分布于：

新皮层（neocortex）

杏仁核（amygdala）

丘脑（thalamus）

海马（hippocampus）

内嗅皮层（entorhinal cortex, EC）

CCK参与神经传递，并调控多种脑功能，包括：

情绪调节

学习和记忆

焦虑

恐惧反应

其中，内嗅皮层（EC）是CCK高度富集的脑区，其主要功能是作为海马和新皮层之间的信息传递枢纽。此外，EC中大多数细胞均表达CCK。

CCK信号对学习和记忆的重要性体现在：

Cck基因敲除小鼠

在被动回避实验（passive avoidance task）中表现更差；

在Morris水迷宫（MWM）实验中出现空间记忆损伤。

此前研究发现：

EC参与听觉皮层人工视听记忆痕迹的编码和提取；

激活EC来源的CCK能神经元能够诱导：

长时程增强（LTP）

神经可塑性

此外，CCK与CCK B型受体（CCKBR）的相互作用对于：

高频刺激诱导的LTP；

声音-声音关联记忆形成；

具有关键作用。

CCK存在多种神经肽变体，可激活不同G蛋白信号，包括：

Gs

Gq

Gi

其中：

硫酸化CCK8（CCK8s）是脑内最丰富的CCK形式。

CCK与阿尔茨海默病（AD）的关系

内嗅皮层（EC）是阿尔茨海默病早期受损的重要区域，其特点包括：

神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles）最早积累；

神经毡丝（neuropil threads）形成；

脑区萎缩；

神经元丢失。

这些都是AD早期典型病理改变。

此前研究发现：

反复给予CCK8s能够增强老年大鼠的空间学习和记忆能力。

因此作者提出假设：

补充外源性CCK8s，增强CCK信号，可能具有改善AD进展的治疗作用。

围绕CCKBR在AD中的作用开展研究：

1. 分析AD过程中CCKBR信号变化

研究：

AD患者和动物模型中CCKBR活性变化；

不同G蛋白信号通路（Gs/Gq/Gi）的作用。

2. 研究CCKBR激动剂治疗AD的效果

比较不同偏向性激动剂：

3. 解析CCKBR结构机制

利用：

冷冻电镜（cryo-EM）

解析：

CCK8s-CCKBR-Gs复合物；

CCK8s-CCKBR-Gq复合物；

CCK8s-CCKBR-Gi复合物。

揭示：

不同CCKBR构象决定其选择性激活不同G蛋白通路。

4. 基于结构设计偏向性药物

利用结构信息设计：

Gi偏向性CCKBR激动剂：z-44

Gq偏向性CCKBR激动剂：3r1

结果发现：

Gq信号激活具有治疗AD潜力，而Gi信号可能没有明显获益。

文章核心逻辑

CCK8s
 ↓
CCKBR受体
 ↓
选择性激活不同G蛋白
 ↓

Gs / Gq  → 神经保护、突触增强、LTP ↑ → 记忆改善

Gi       → 无明显治疗作用

 ↓

Gq偏向性激动剂3r1
 ↓
ADAM10 ↑
PLCB4 ↑
Ca2+信号增强
 ↓
LTP增强
 ↓
Aβ斑块减少
 ↓
AD小鼠认知改善

结果1、CCK通过激活脑内CCKBR缓解记忆衰退

1. AD过程中CCK/CCKBR信号发生改变

由于内嗅皮层（entorhinal cortex, EC）是AD最早发生病理改变的脑区之一，研究者首先分析AD进展过程中CCK信号变化。

在晚期AD模型 5×FAD小鼠中发现：

EC区域CCK表达下降约90%

与年龄匹配的正常小鼠相比显著降低；

相反：

海马和皮层区域CCKBR受体表达升高。

说明：

AD过程中，CCK配体减少，但CCKBR受体出现代偿性增加。

2. CCKBR缺失导致学习记忆障碍

研究CCKBR敲除小鼠：

Cckbr-/- 小鼠 vs Cckbr+/+小鼠

发现：

学习能力下降；

记忆能力下降；

海马和皮层区域LTP（长时程增强）减弱。

提示：

CCK-CCKBR信号缺陷与AD中的记忆损害密切相关。

3. 外源性CCK8s可以保护神经元

研究假设：

增强CCKBR活性可能减缓AD进程并保护神经元。

但是：

CCK8s不能穿过血脑屏障（BBB）；

长期硬膜外给药可能造成脑损伤。

因此作者首先进行了体外实验。

Aβ诱导神经损伤模型

使用：

Aβ42处理原代皮层神经元

结果：

Aβ42 → 神经元存活率下降

加入CCK8s：

→ 显著恢复神经元活性

说明：

CCK8s具有抵抗Aβ神经毒性的保护作用。

4. CCK8s作用依赖CCKBR，而不是CCKAR

为了确定CCK受体类型：

阻断：

CCKBR

使用：

CCKBR拮抗剂 L365260

CCKBR shRNA敲低

结果：

→ CCK8s神经保护作用明显下降。

CCKAR

使用：

CCKAR拮抗剂 devazepide

CCKAR shRNA敲低

结果：

→ 不影响CCK8s保护作用。

因此：

CCK8s主要通过CCKBR发挥神经保护作用，而非CCKAR。

5. CCKBR激活多个G蛋白信号

CCKBR属于GPCR受体，可以激活：

Gs

Gq

Gi

通过：

cAMP检测（Gs）

AP-TGFα shedding检测（Gq）

cAMP抑制实验（Gi）

发现：

CCK8s能够同时激活CCKBR下游：

6. Gs和Gq负责神经保护，Gi作用相反

进一步使用不同抑制剂：

阻断Gs：

药物：

NF449

结果：

→ CCK8s保护作用消失

阻断Gq：

药物：

PLC抑制剂U73122

结果：

→ CCK8s保护作用消失

阻断Gi：

药物：

百日咳毒素（PTX）

结果：

→ 神经元存活进一步增加

说明：

7. Gs/Gq促进神经结构恢复

利用：

Gnαq flox小鼠

Gnαs flox小鼠

Cckbr-Cre病毒

特异性降低CCKBR神经元中的：

Gs表达

Gq表达

结果：

降低Gs/Gq：

↓

CCK8s保护作用消失：

轴突长度恢复下降；

树突棘形成减少；

细胞存活降低。

说明：

CCKBR介导的神经保护依赖Gs和Gq，而不是Gi。

8. AD患者中CCKBR-Gq信号下降

研究者进一步分析78名AD患者脑脊液（CSF）。

分组：

检测脑脊液多肽成分激活CCKBR能力。

结果：

CCKBR-Gq信号：

重度AD患者：

↓ 明显降低

CCKBR-Gi信号：

重度AD患者：

↑ 增强

提示：

AD进展过程中，CCKBR信号发生偏移：有益的Gq信号下降，而Gi信号增强。

9. AD患者CCK8s减少导致Gq下降

质谱分析CSF中的CCK肽：

检测：

CCK8s

CCK4

结果：

CCK8s：

重度AD：

↓↓降低

CCK4：

重度AD：

↑升高

原因：

• CCK8s倾向激活Gq；
• CCK4可能产生不同G蛋白偏向。

因此：

AD晚期由于CCK8s减少，而CCK4增加，导致CCKBR-Gq活性下降。

结果2、CCK8s-CCKBR-G蛋白复合物结构解析

冷冻电镜解析CCKBR不同G蛋白复合物结构

研究者解析了3种CCK8s-CCKBR复合物结构：

CCK8s-CCKBR-Gq

CCK8s-CCKBR-Gs

CCK8s-CCKBR-Gi1

分辨率分别达到：

Gq：3.3 Å

Gs：3.0 Å

Gi：3.1 Å

虽然已有胃泌素（gastrin-17）-CCKBR-Gi/Gq结构，但：

gastrin-17主要存在于胃肠道；

CCK8s主要富集于脑内，并且激活CCKBR-Gq/Gs能力更强。

因此，采用CCK8s-CCKBR-Gs/Gq/Gi结构研究脑内CCKBR信号偏向机制。

CCK8s不同结合模式决定G蛋白偏向性

三种复合物中，CCK8s均呈现类似：

“倒置鱼钩（inverted fish hook）”结构

C端F8深入受体结合口袋底部。

不同区域的CCK8s-CCKBR相互作用决定不同G蛋白选择性。

CCK8s N端区域（T区域）决定Gs偏向

位置：

CCK8s前3个氨基酸：

D1

Y2

M3

作用：

突变D1/Y2/M3后：

→ Gs激活能力下降最明显

而Gi、Gq影响较小。

关键相互作用：

CCK8s：

Y2

M3

与CCKBR：

P114

Q204ECL2

H364ECL3

形成较强结合。

突变这些受体残基：

P114A

Q204A

H364A

导致：

→ Gs信号显著下降。

结论：

CCK8s N端区域与CCKBR P114/Q204/H364形成热点，是CCKBR-Gs选择性激活的关键。

CCK8s中间区域（M区域）决定Gq偏向

关键残基：

M6

D7

突变：

M6A

D7A

结果：

→ 主要降低Gq信号

对Gs和Gi影响较小。

关键结合位点：

CCK8s：

M6

D7

结合CCKBR：

F110²·⁶⁰

H207ECL2

N353⁶·⁵⁵

突变：

F110A

H207F

N353A

导致：

→ Gq激活能力明显降低。

结论：

CCK8s中间区域与F110/H207/N353相互作用，是CCKBR-Gq选择性的结构基础。

CCK8s C端区域（B区域）决定Gi偏向

关键残基：

F8

作用：

F8与：

W346⁶·⁴⁸

形成结合，

并通过：

Y350⁵·⁵²

间接稳定。

C端还与：

T111²·⁶¹

H376⁷·³⁹

形成极性相互作用。

突变：

F8A

T111A

H376A

Y380A

结果：

→ 选择性削弱Gi信号

不同区域对应不同G蛋白偏向

研究意义

结构和功能实验共同证明：

CCKBR不同构象状态决定G蛋白选择性；

配体与受体不同区域的相互作用决定信号偏向。

因此可以通过：

靶向CCKBR特定结合区域 → 设计偏向性激动剂

例如：

Gs偏向激动剂

Gq偏向激动剂

Gi偏向激动剂

用于精准调控AD相关神经功能。

结果3、基于结构设计CCKBR-Gi偏向性激动剂（Lyz-866和z-44）

设计思路

为研究CCKBR-Gi信号功能，作者设计Gi偏向性激动剂。

由于删除CCK8s前4个氨基酸可：

消除CCKAR激活；

保留CCKBR活性；

因此选择CCK4（W5-M6-D7-F8）作为模板，开发CCKBR选择性激动剂。

Lyz-866的设计与优化

计算模拟发现：

对CCK4 N端进行乙酰化（Ac-CCK4）可增强其与CCKBR H364ECL3的氢键作用；

Gi信号激活能力提高约2.5倍。

在苯丙氨酸（F8）侧链引入溴原子形成 Lyz-866：

活性提高约8倍（EC50≈0.27 nM）；

生物利用度提高；

对CCKBR具有选择性。

功能实验显示：

Lyz-866是CCKBR Gi偏向性激动剂。

Lyz-866结构机制

冷冻电镜解析：

Lyz-866与CCK8s的W5-M6-D7-F8区域具有类似构象。

但存在增强作用的关键相互作用：

① N端乙酰基：

与CCKBR H364ECL3形成额外氢键；

② 主链：

与 V206ECL2形成额外作用；

③ C端溴代苯环：

旋转约30°；

与疏水口袋形成更强堆积。

突变H364或V206：

→ 显著降低Lyz-866活性。

说明这些位点决定Lyz-866增强活性。

进一步设计高度Gi偏向激动剂z-44

问题：

Lyz-866虽然偏向Gi，但仍与：

H207ECL2（Gq相关位点）

H3767.39/Y3807.43（Gi相关位点）

同时作用。

设计策略：

删除Lyz-866 N端两个残基；

减少与H207ECL2（Gq相关）的作用；

优化D7和F8结构。

最终获得：

z-44

特点：

完全失去：

Gs激活能力；

Gq激活能力；

保留：

Gi激活能力。

因此：

z-44是高度Gi偏向性的CCKBR激动剂。

z-44结构基础

cryo-EM显示：

z-44采用类似Lyz-866 C端D7-F8的线性构象；

位于配体结合口袋底部。

关键作用：

D7替换为羟基苯结构后：

增强与H3767.39和Y3807.43结合；

诱导这两个残基重新定位；

强化Gi信号。

CCKBR选择性的结构基础

Lyz-866和z-44：

激活CCKBR；

不激活CCKAR。

原因：

CCKBR特异残基：

TM3区域：

M1343.32

V1383.36

TM6区域：

H3767.39

Y3807.43

决定CCKBR选择性。

突变这些位点：

→ z-44和Lyz-866活性下降。

结果4、基于结构设计CCKBR-Gq偏向性激动剂3r1

设计思路：利用Lyz-866结构开发Gq偏向激动剂

作者解析了 Lyz-866-CCKBR-Gq复合物结构，以Lyz-866为模板设计Gq偏向性激动剂。

重点保留核心药效区域：

W5

M6

D7

作为Gq激活的结构基础。

Lyz-866结合CCKBR-Gq与Gi存在构象差异

比较Lyz-866-CCKBR-Gq和Lyz-866-CCKBR-Gi结构发现：

D7侧链旋转约60°

伴随R356⁶·⁵⁸远离W5；

改变受体构象。

M6附近疏水作用重新排列：

F110²·⁶⁰

F120ECL1

F122ECL1

与M6相互作用减少。

C端F8-Br旋转约35°；

引起CCKBR构象开关残基变化：

W346⁶·⁴⁸

H376⁷·³⁹

Y380⁷·⁴³

说明：

配体诱导CCKBR不同构象，是G蛋白偏向性的结构基础。

基于Lyz-866筛选Gq偏向性化合物

作者对Lyz-866进行结构改造：

W5位点优化：

替换：

苯丙氨酸（W5）

亮氨酸

丙氨酸

得到：

a1-a3

结果：

→ CCKBR活性明显下降。

D7位点优化：

替换：

氨基丙二酸

谷氨酸

组氨酸

得到：

c1-c3

结果：

→ 活性降低。

说明：

W5和D7对CCKBR激活非常关键。

4. 发现高效Gq偏向激动剂3r1

关键改造：

将M6替换为：

DL-norleucine（DL-正亮氨酸）

获得：

3r1

特点：

Gq激活能力提高约1000倍；

EC50 = 0.035 ± 0.003 nM；

最大效应（Emax）：

约为CCK8s的159%；

同时：

Gi激活基本不变。

因此：

3r1是CCKBR高度Gq偏向性激动剂。

偏向因子：

β = 0.99 ± 0.20

5. 3r1-CCKBR-Gq结构揭示Gq偏向机制

冷冻电镜解析：

M6→DL-norleucine改变

导致：

与V130³·²⁸、M134³·³²疏水作用消失；

更靠近T111²·⁶¹；

整个配体上移约1 Å。

结果：

增强：

D7与H207ECL2；

D7与R356⁶·⁵⁸

相互作用；

减少：

与N353⁶·⁵⁵作用。

F8-Br构象变化

F8-Br旋转约150°：

减少：

Br与V349⁶·⁵²/Y350⁶·⁵³作用；

增加：

Br与：

M186⁴·⁵⁷

Y189⁴·⁶⁰

L222⁵·⁴²

相互作用。

6. 3r1关键结合热点

突变实验发现：

以下残基决定3r1高活性和Gq偏向：

Y189⁴·⁶⁰

H207ECL2

R356⁶·⁵³

这些位点增强：

CCKBR结合亲和力；

Gq信号激活。

结果5、3r1通过上调ADAM10和PLCB4发挥其有益作用

体外实验：3r1浓度依赖性地提高Aβ42处理的神经元存活率，促进神经元分支和轴突生长，而z-44无保护作用。

体内行为学：长期给予3r1能显著改善5×FAD小鼠在水迷宫和新物体识别实验中的学习记忆能力，而z-44和CCK8s无效。

突触功能：3r1和CCK8s均能挽救AD小鼠海马长时程增强（LTP）的损伤。

Tau病理：3r1能显著降低AD小鼠皮层磷酸化Tau水平，而z-44和CCK8s无此效应。

结论：Gq偏向性CCKBR配体3r1通过减轻神经元凋亡、改善突触可塑性和降低Tau磷酸化，有效缓解AD模型小鼠的学习记忆障碍，而Gi偏向性配体z-44无效，提示Gq信号通路在CCKBR介导的AD治疗中起关键作用。

结果6、3r1改善AD模型小鼠认知功能的分子机制

减轻Aβ病理：3r1显著减少5×FAD小鼠脑内淀粉样斑块数量。

转录组分析：3r1上调海马中“钙信号通路”和“cGMP-PKG通路”相关基因，下调“AD通路”相关基因。

调控分泌酶平衡：3r1特异性上调α-分泌酶（ADAM10）的表达和活性（mRNA和蛋白水平均升高），增加无毒性的sAPPα生成，而对β-和γ-分泌酶无影响；使用ADAM10抑制剂可阻断3r1的神经保护效应。

PLCB4是关键下游分子：3r1通过CCKBR-Gq信号上调Plcb4表达；敲低Plcb4可阻断3r1对神经元分支、轴突生长和抗凋亡的保护作用。

信号通路完整链条：3r1 → CCKBR → Gq → PLCB4 → ADAM10上调 → 减少Aβ生成 + 促进神经元生长 → 改善认知功能（图7总结）。

抗炎作用：3r1还降低了海马中促炎基因的表达。

结论：3r1通过激活CCKBR-Gq-PLCB4-ADAM10信号轴，同时发挥抗Aβ病理、促神经元存活和抗炎等多重效应，从而在AD模型中实现认知保护。这进一步证实了Gq偏向性CCKBR信号在AD治疗中的关键地位。

最后，来看看方法

分子对接

分子动力学

生活很好，有你更好。