**摘要：**细胞外基质是干细胞来源肝组织工程中的关键工艺变量，直接影响多能干细胞扩增、肝细胞与内皮细胞定向分化、三维组织自组装以及移植后功能维持。本文结合一项发表于《Cells》的研究，解析全长人重组层粘连蛋白Laminin521与Laminin111在肝组织构建中的应用流程，并重点比较单一LN521基质与LN521、LN111混合基质对二维分化、三维肝球结构稳定性、肝功能成熟度、规模化制备和体内移植表现的影响，为干细胞来源肝组织的基质选型及工艺开发提供参考。
**关键词：重组层粘连蛋白、全长人层粘连蛋白、Laminin521、Laminin111、LN521、LN111、全长人重组层粘连蛋白、人胚胎干细胞、hESC、肝细胞分化、肝组织工程、细胞外基质、层粘连蛋白521基质**
## 一、肝组织工程为什么需要标准化细胞外基质

终末期肝病的临床治疗长期受到供体器官数量有限的制约，因此，利用人多能干细胞构建具有肝脏合成、代谢和分泌功能的人工肝组织，成为再生医学与组织工程领域的重要研究方向。相比单纯获得肝样细胞，真正具有转化价值的肝组织构建还需要解决细胞数量、分化成熟度、组织结构稳定性、血管化以及体内功能维持等多个问题，而这些环节都与细胞所处的细胞外基质环境密切相关。
细胞外基质不仅承担细胞黏附的物理支撑作用，还能够通过整合素等受体向细胞传递增殖、存活、极性建立和谱系分化信号。对于人胚胎干细胞等多能干细胞而言，基质组成会影响细胞复苏、克隆扩增、遗传稳定性和多能性维持；进入定向分化阶段后，不同基质又会影响肝祖细胞、内皮细胞等目标细胞的形成效率；在三维组织构建过程中，基质还会进一步影响细胞自组装、组织内部营养交换和长期结构完整性。因此，基质并不是独立于分化配方之外的辅助耗材，而是贯穿整个组织构建流程的工艺参数。
传统基质材料种类较多，但部分材料可能存在成分不完全明确、批次差异较大或含有动物来源组分等问题。这些因素在早期探索实验中可能不会立即造成明显影响，但随着实验进入多批次重复、工艺放大和转化验证阶段，基质差异可能表现为细胞产量波动、分化效率不稳定、组织形态不一致以及实验结果难以跨机构复现。全长人重组层粘连蛋白具有成分明确、来源可追溯和批次相对稳定等特点，并能够通过不同层粘连蛋白亚型模拟发育阶段及组织微环境中的特定信号，因此逐渐被用于多能干细胞培养和组织工程工艺开发。
近期发表于《Cells》的一项研究以临床级人胚胎干细胞为起始材料，通过优化Laminin521和Laminin111基质组合，完成了肝祖细胞、内皮细胞分化、血管化三维肝球构建、规模化制备以及第三方体内移植验证。该研究不仅比较了不同基质配方对细胞分化的影响，还将评价周期延长至六周，并进一步验证了组织运输和体内功能表现，为重组层粘连蛋白基质在肝组织工程中的应用提供了较完整的工艺案例。
## 二、研究所用基质与肝组织构建流程

### 2.1 实验所用重组层粘连蛋白

研究使用的细胞外基质为BioLamina提供的全长人重组层粘连蛋白Laminin521与Laminin111。两种基质均属于成分明确的商业化重组蛋白材料，但其生物学作用并不完全相同。LN521常用于支持人多能干细胞的存活、自我更新和稳定扩增，能够为单细胞或小克隆培养提供较适合的黏附与存活信号；LN111则更多与胚胎发育早期及部分组织分化环境相关，可参与调节细胞极性、分化和组织形态形成。
研究并未将层粘连蛋白只用于某一个分化步骤，而是将基质包被贯穿从干细胞扩增到三维肝组织构建的全部工艺阶段。通过在不同阶段保持相对明确的基质环境，研究者能够更系统地比较单一LN521与LN521、LN111混合配方对细胞命运和组织稳定性的长期影响。
### 2.2 重组层粘连蛋白贯穿全部培养阶段

在干细胞扩增阶段，培养器皿提前24小时完成重组层粘连蛋白包被，用于支持临床级hESC复苏、传代和规模化扩增。对于后续组织工程而言，这一阶段的重点不仅是获得足够数量的细胞，还需要保证细胞具有稳定多能性和较好的分化起点。如果扩增阶段出现细胞状态不均一、异常分化或遗传稳定性下降，后续即使调整分化因子，也难以获得一致的肝细胞和内皮细胞产品。
进入定向分化阶段后，研究分别对肝细胞分化容器和内皮细胞分化容器进行基质包被，使同一批起始hESC分别向肝祖细胞和内皮细胞谱系分化。分化获得的两类功能细胞随后按照设定比例混合，并在三维条件下自组装形成具有血管相关细胞组分的肝球体。由此可见，重组层粘连蛋白基质既参与二维细胞扩增和分化，也间接影响后续三维组织的细胞组成、结构形成和长期功能。
![层粘连蛋白应用于肝组织构建的流程示意图](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/c15f7e371224bebe292c64c56fdc3bdb.jpg)
图1. 重组层粘连蛋白基质应用于肝组织构建的流程示意图，从多能干细胞扩增到3D肝球体的分化路径
## 三、不同层粘连蛋白配方对二维分化的影响

研究重点比较了单一Laminin521基质和LN521、LN111混合基质的应用效果。结果显示，在二维干细胞扩增和早期定向分化阶段，两种基质配方均能够支持hESC维持多能性，并完成肝细胞谱系和内皮细胞谱系的定向分化。这说明单一LN521与混合基质在完成基础二维分化任务方面均具有可行性，两种方案之间更明显的差异主要在后续三维长期培养阶段逐渐表现出来。
在肝细胞分化实验中，hESC经过相应诱导后形成表达肝细胞核因子4α（HNF4α）和甲胎蛋白（AFP）的肝祖细胞。HNF4α是肝细胞命运建立及肝功能基因调控的重要转录因子，AFP则通常与较早期或未完全成熟的肝细胞状态相关。第9天免疫荧光结果显示，两种基质条件下均能够获得HNF4α和AFP阳性细胞，说明LN521与混合基质都可以支持hESC进入肝细胞谱系。
![人胚胎干细胞在不同层粘连蛋白基质上向肝祖细胞分化实验结果](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/b89effe8dd24ed8656646f75b5c7973c.jpg)
图2. 人胚胎干细胞在不同重组层粘连蛋白基质上向肝祖细胞分化实验结果；第9天肝祖细胞免疫荧光染色显示细胞表达肝细胞核因子4α（HNF4α）与甲胎蛋白（AFP）；放大倍数10倍。白色方框区域为局部放大视野。KOSR：无血清替代物；DMSO：二甲基亚砜；HGF：肝细胞生长因子；OSM：抑瘤素M
在内皮细胞分化实验中，第5天细胞表达血管内皮钙黏蛋白和CD31。血管内皮钙黏蛋白参与内皮细胞间连接建立，CD31则是常用的内皮细胞标志物。两种基质条件均能支持内皮细胞标志物表达，说明其可以满足后续血管化肝组织构建所需的内皮细胞制备要求。二维阶段结果同时说明，若只观察短期分化标志物，单一LN521和混合基质之间的差异可能并不明显，因此基质评价还需要进一步延伸至三维培养和长期功能检测。
![人胚胎干细胞在不同人层粘连蛋白基质上向内皮细胞分化实验结果](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/075113450527517e054b6d79d7e90948.jpg)
图3. 人胚胎干细胞在不同人层粘连蛋白基质上向内皮细胞分化实验结果；第5天内皮细胞免疫荧光结果显示细胞表达血管内皮钙黏蛋白（VE-CADH）与CD31；放大倍数10倍。白色方框代表特定区域放大图。BMP4：骨形态发生蛋白4；VEGF：血管内皮生长因子
## 四、混合基质对三维肝球长期结构稳定性的影响

虽然两种基质均能支持二维分化，但在持续六周的三维肝球培养过程中，单一LN521和LN521、LN111混合基质的表现逐渐出现明显差异。使用单一Laminin521制备的肝球随着培养时间延长，逐渐出现颗粒状和结构不均一的形态，内部表现出形成坏死核心的趋势。三维组织内部如果出现营养和氧传递不足，中心区域细胞容易发生应激和死亡，继而影响组织整体结构和功能稳定性。
相比之下，使用Laminin521与Laminin111混合基质获得的细胞所构建的肝球，整体形态更加均一，并能够在较长培养周期中保持较好的结构完整性。这表明LN111的加入可能为细胞提供了不同于单一LN521的黏附与分化信号，使形成的肝细胞和内皮细胞在进入三维组装后具有更适合长期组织维持的状态。
需要注意的是，研究中的层粘连蛋白主要用于前期二维包被和细胞分化，而三维肝球的差异在后续长期培养中持续出现。这说明基质在细胞早期培养阶段形成的信号影响，可能延续至三维组织形成和长期成熟阶段。对于组织工程工艺开发而言，基质评价不能只局限于细胞是否贴壁或短期分化效率，还应关注其对后续组织结构、细胞互作和长期功能的影响。
![不同基质配方下人多能干细胞形成三维肝脏球体的示意图](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/d84fd5eca7a0fe336f51446b799d85d2.jpg)
图4. 不同基质配方下人多能干细胞培育形成三维肝脏球体的示意图，比例尺400 μm
## 五、混合基质对肝功能成熟和维持的作用

除组织形态外，研究还通过多项分泌和代谢指标评价肝球在六周培养过程中的功能变化。结果显示，LN521与LN111混合基质来源的肝球表现出逐步成熟的趋势，其中胎儿期标志物甲胎蛋白分泌量随培养时间逐渐下降，而白蛋白和α1-抗胰蛋白酶的分泌能够保持相对稳定，细胞色素P450 CYP1A2代谢活性也维持在可检测和可用水平。
AFP下降通常被用于反映肝样细胞由较早期状态向更成熟状态转变，而白蛋白是评价肝细胞合成功能的重要指标。α1-抗胰蛋白酶同样由肝细胞合成和分泌，其稳定表达可作为肝功能维持的补充证据。CYP1A2属于肝脏药物代谢相关酶，其活性能够反映肝细胞代谢功能。将这些指标结合起来观察，比单独检测一个分化标志物更有利于判断三维肝组织是否实现持续成熟。
已有相关研究也提示，混合层粘连蛋白基质培养获得的肝细胞成熟度可能优于单一LN521体系。基于本研究的结构和功能结果，研究团队最终选择LN521、LN111混合基质工艺，用于后续规模化制备和体内移植实验。这一选择说明，基质配方优化的目标不是单纯提高某一时间点的细胞数量，而是寻找能够兼顾细胞扩增、定向分化、三维稳定性和长期肝功能的整体方案。
![LN521与LN111混合基质培养肝球体的表型和分泌功能分析](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/8d955d2b0a48c6ae651fac97dfb80b16.jpg)
图5. 重组层粘连蛋白混合基质LN521:LN111培养肝球体表型分析、血清蛋白分泌检测；每周通过ELISA测量肝球体的AFP、ALB、A1AT及CYP1A2表达水平
## 六、基质标准化如何支持工艺规模化

组织工程研究从实验室验证走向规模化制备时，需要证明工艺能够适配不同培养容器和细胞批量，并在扩大规模后继续保持产品一致性。该研究中的优化基质工艺可以从6孔板扩展至T175培养瓶，不同规格均设置相应的接种密度和培养参数，从而批量制备肝祖细胞、内皮细胞及后续肝球产品。
从6孔板扩大至T175培养瓶，并不是简单增加培养液和细胞数量。培养面积、细胞铺展状态、营养交换、包被均匀性和操作时间都可能影响最终结果。重组层粘连蛋白成分明确、包被条件可记录，有助于将基质浓度、包被时间、单位面积用量等参数纳入标准操作流程。相比成分变化较大的复杂基质，这类材料更适合建立可重复的放大工艺。
制备完成的肝组织经过质量控制后，通过冷链运输至第三方合同研究组织开展体内实验。跨机构运输会增加时间、温度、机械扰动和操作差异等变量，因此能够在运输后继续用于移植实验，也从侧面说明该工艺制备的组织具有一定稳定性。对于转化研究而言，跨机构验证能够减少单一实验室操作习惯对结果的影响，并检验工艺文件能否被其他团队执行。
## 七、体内移植功能验证结果

研究采用肾被膜下注射和皮下支架移植两种方式验证干细胞来源肝组织的体内功能。肾被膜下具有较丰富的血液供应，是小动物细胞和组织移植研究中常用的部位。结果显示，肾被膜下移植肝组织后14天，仍可以在小鼠血浆中检测到人白蛋白，说明移植组织中的人源肝细胞在体内能够继续发挥一定的蛋白合成功能。
另一种方式是将肝组织结合聚己内酯支架进行皮下移植。移植初期可以在循环中检测到人白蛋白，并且植入部位形成了较好的血管化结构，未观察到明显排斥表现。皮下环境与天然肝脏环境存在较大差异，因此，在该位置仍能检测到组织存活和人白蛋白分泌，说明混合基质工艺获得的细胞具有一定体内功能潜力。
不过，这些结果仍属于小动物、短期功能验证。人白蛋白的检出能够证明组织在一段时间内具有合成功能，但尚不能说明其已经具备完整肝脏代谢、解毒和长期替代能力。后续仍需进一步评价组织长期存活、血管连接、代谢酶谱、结构成熟度以及在肝损伤模型中的功能改善效果。
![两种体内移植方式的设计与功能验证结果](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/6b879fba7687d81ea71b9e5ac8a81843.jpg)
图6. 两种体内移植方式的设计与功能验证结果；人白蛋白（Albumin）
## 八、重组层粘连蛋白基质常见问题

### Q1：肝组织工程中为什么选择重组层粘连蛋白作为基质材料？

重组层粘连蛋白具有化学成分明确、来源可追溯和批次稳定性相对较好的特点，可以减少复杂天然基质中成分波动带来的影响。同时，不同层粘连蛋白亚型能够与细胞表面的特定受体相互作用，从而调节细胞黏附、存活、增殖和分化。对于需要经历多能干细胞扩增、肝细胞分化、内皮细胞分化和三维组织构建的工艺而言，标准化重组基质更便于建立可重复、可记录和可放大的操作流程。
### Q2：单一LN521与LN521、LN111混合配方有什么差异？

本研究显示，两种配方均能支持hESC二维扩增，并能够获得HNF4α阳性肝祖细胞和VE-CADH阳性内皮细胞，因此在早期二维分化阶段均具有可行性。差异主要出现在三维长期培养阶段，LN521、LN111混合配方来源的肝球形态更加均一，长期结构完整性更好，并能够维持较稳定的白蛋白、A1AT和CYP1A2相关功能，更适合长周期培养和后续体内移植验证。
### Q3：混合基质为什么可能提高三维肝组织稳定性？

LN521与LN111能够向细胞提供不同的黏附和分化信号。LN521更有利于多能干细胞稳定扩增，LN111则与胚胎发育及早期组织分化环境密切相关。两种基质组合可能使肝祖细胞和内皮细胞在进入三维组装前获得更适合组织形成和成熟的状态，从而改善肝球内部细胞互作、结构维持和长期功能。但具体作用机制仍需要通过整合素表达、细胞极性、转录组和组织空间结构等研究进一步分析。
### Q4：该研究成果距离临床应用还有哪些步骤？

目前研究已完成体外基质配方优化、不同培养规格的工艺放大、跨机构运输和小动物体内功能验证，但距离临床应用仍需经过更长时间和更高层级的验证。后续需要在大动物模型中评价长期安全性、组织存活、血管连接和功能有效性，同时还需要完善细胞原料、培养基、基质、制备过程、运输和终产品放行标准，并建立符合临床转化要求的生产与质量控制体系。
## 九、总结

细胞外基质是人多能干细胞来源肝组织构建中的核心工艺变量，其影响范围贯穿干细胞复苏与扩增、肝祖细胞和内皮细胞分化、三维肝球组装、长期功能维持、规模化制备和体内移植。研究结果表明，单一LN521和LN521、LN111混合基质均能够支持二维细胞培养和定向分化，但二者在三维长期培养中的表现并不相同。
与单一LN521相比，LN521、LN111混合基质来源的肝球具有更加均一的组织形态，能够在六周培养周期内维持较好的结构完整性，并呈现AFP下降、ALB和A1AT稳定分泌以及CYP1A2代谢活性维持等成熟趋势。基于这些结果建立的工艺能够适配从6孔板到T175培养瓶的不同培养规模，并完成跨机构运输和两种体内移植方式的初步验证。
该研究说明，组织工程中的基质选型不能只依据细胞短期贴壁和分化结果，还应将三维结构稳定性、长期功能、放大适配性和体内表现纳入综合评价。通过使用成分明确的全长人重组层粘连蛋白并优化不同亚型组合，可以为干细胞来源肝组织建立更标准化的培养环境，也为后续工艺放大和转化验证提供技术基础。

|资料来源与产品信息|
|:-:|
|本文基于《Cells》期刊公开研究文献（DOI: 10.3390/cells15100905）整理，仅用于科研信息分享与实验操作参考。若涉及版权问题，烦请联系我方进行下架处理。研究中所用Laminin521、Laminin111来自BioLamina公司。|

摘要：细胞外基质是干细胞来源肝组织工程中的关键工艺变量，直接影响多能干细胞扩增、肝细胞与内皮细胞定向分化、三维组织自组装以及移植后功能维持。本文结合一项发表于《Cells》的研究，解析全长人重组层粘连蛋白Laminin521与Laminin111在肝组织构建中的应用流程，并重点比较单一LN521基质与LN521、LN111混合基质对二维分化、三维肝球结构稳定性、肝功能成熟度、规模化制备和体内移植表现的影响，为干细胞来源肝组织的基质选型及工艺开发提供参考。关键词：重组层粘连蛋白、全长人层粘连蛋白、Laminin521、Laminin111、LN521、LN111、全长人重组层粘连蛋白、人胚胎干细胞、hESC、肝细胞分化、肝组织工程、细胞外基质、层粘连蛋白521基质

重组层粘连蛋白基质在干细胞来源肝组织构建中的应用与优化|laminin521/LN521/Biolamina

细胞外基质是干细胞来源肝组织工程中的关键工艺变量，直接影响多能干细胞扩增、肝细胞与内皮细胞定向分化、三维组织自组装以及移植后功能维持。本文结合一项发表于《Cells》的研究，解析全长人重组层粘连蛋白Laminin521与Laminin111在肝组织构建中的应用流程，并重点比较单一LN521基质与LN521、LN111混合基质对二维分化、三维肝球结构稳定性、肝功能成熟度、规模化制备和体内移植表现影响

应用科学家

其他

细胞外基质是干细胞肝组织工程的关键变量，研究比较了Laminin521与Laminin111混合基质在肝细胞分化、三维肝球稳定性及移植功能的表现。混合基质显著提升组织形态均一性，维持白蛋白分泌和CYP1A2代谢活性，为临床级肝组织构建提供标准化方案。关键词：重组层粘连蛋白、肝细胞分化、三维肝球、组织工程、干细胞移植。

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