课前准备（Stereo-seq）--PD-1阻断可解除局部乙型肝炎病毒相关B细胞应答对肝细胞癌的抑制作用

作者，Evil Genius

今日我们分享华大的文章，现在发个文章共一看看有多少个，可见科研需要团队合作了，单打独斗不太现实，但是也要注意目前单细胞空间的研究主要还是发现生物学问题的核心关键，如何解决这个问题，才是后续更加艰苦的研究，文章一般要求提供一个可能的解决思路即可，分子对接/分子动力学采用的比较多，我相信有的学员将来会走向更高的平台，到那时候，重点就变成了如何解决问题了。

知识积累

研究背景

肝细胞癌（HCC）术后复发率极高，主要与隐匿性微转移有关。

新辅助/辅助免疫治疗被探索用于降低或延缓复发。

三项II期试验显示，新辅助PD-1阻断在早期HCC中效果良好，尤其在T细胞富集型患者中。

复发性HCC的CD8⁺ T细胞浸润高于原发性HCC，提示抗PD-1适合用于预防再次复发。

传统认知的局限

传统观点认为，抗PD-1等免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤免疫主要依赖肿瘤浸润T细胞。

但缺乏T细胞克隆扩增的癌症患者（如部分HCC、肉瘤、肺癌）同样观察到疗效，表明存在T细胞以外的替代机制。

B细胞和三级淋巴结构（TLS）的新作用

近年研究发现，B细胞和TLS与免疫治疗更好应答及长期生存相关。

TLS可在肿瘤局部产生靶向肿瘤的抗体。

这些抗体的抗肿瘤机制包括：抗体依赖性吞噬作用（ADCP）、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。

研究发现，在HBV相关复发性HCC中，抗PD-1治疗除激活T细胞外，还能诱导针对乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）的体液免疫应答（B细胞/抗体反应）。

结果1、围手术期抗PD-1单药治疗在可切除复发性HCC患者中显示活性

NCT04615143，纳入17例可切除复发性HCC患者，评估围手术期抗PD-1单药治疗的疗效和安全性。

治疗方案：术前新辅助抗PD-1两剂 → 手术切除 → 术后辅助抗PD-1单药治疗持续一年或至疾病进展/复发。

全部患者均有慢性HBV感染史，88%既往接受过抗病毒治疗，除2例外其余均处于HBV非活动/非复制状态。

所有患者均完成新辅助治疗并接受手术，仅出现轻微1级不良事件，无严重并发症或4/5级不良事件。

组织学评估：1例完全缓解（pCR），1例部分缓解（存活肿瘤细胞≤50%）。

多组学分析方法

共收集55份样本，对所有组织进行scRNA-seq联合scTCR-seq/scBCR-seq。

对治疗后肿瘤切片进行空间Stereo-seq和原位全长BCR/TCR测序（SMRT-seq），探索肿瘤免疫微环境（TiME）的空间动态。

共获得370,057个细胞，鉴定出8个主要细胞群体，进一步细分为37个亚群。

T细胞扩增分型

利用scTCR-seq对181,753个T细胞进行克隆型定义，根据扩增克隆T细胞百分比将肿瘤病灶分为高T细胞扩增组和低T细胞扩增组。

晚期复发组中：高T细胞扩增占38.5%，低T细胞扩增占61.5%；早期复发组中比例相似（37.5% vs 62.5%）。

两种不同的应答亚型（晚期复发组）

T型晚期复发（高T细胞扩增）：肿瘤中PD-1⁺CD8⁺ T细胞比例在治疗前即较高，治疗后进一步增加，以T细胞应答为主导。

B型晚期复发（低T细胞扩增）：治疗后血浆细胞比例显著升高，以B细胞/体液免疫应答为主导。

同一患者的多个肿瘤病灶可同时存在T型和B型特征，二者并非互斥。

早期复发组与其它免疫细胞变化

早期复发组中，高T细胞扩增组治疗后CD8⁺ T细胞浸润增加，但低T细胞扩增组未出现B细胞应答增强。

两组晚期复发患者中，巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞在治疗后均显著上调免疫激活及抗原加工呈递相关通路。

仅晚期复发组（T型和B型）在治疗后巨噬细胞吞噬活性和树突状细胞成熟特征显著增强。

复发性HCC患者对围手术期抗PD-1治疗的应答存在两种不同机制：一种以T细胞扩增为主导（T型），另一种以B细胞/体液免疫应答为主导（B型），且B型应答与T细胞低扩增相关。 早期复发患者缺乏有效的B细胞应答增强，提示B细胞介导的免疫可能是实现长期无病生存的关键因素之一。

结果2、两种效应细胞对晚期复发患者中PD-1阻断产生应答

两种效应细胞类型

PD-1表达主要限于T细胞亚群，包括CD8_Tex_CXCL13细胞、CD4⁺ Tfh细胞和增殖性T细胞。

T型晚期复发组：CD8_Tex_CXCL13细胞是主要效应细胞，治疗后PD-1表达升高、激活增强、抗肿瘤细胞毒性增加。

B型晚期复发组：CD8_Tex_CXCL13和PD-1⁺ Tfh细胞均高度克隆扩增，其中PD-1⁺ Tfh细胞是连接B细胞免疫应答的关键桥梁。

Tfh细胞的抗肿瘤作用间接（通过B细胞/抗体途径），而CD8_Tex可直接杀伤肿瘤细胞。

T型晚期复发的特征

T型晚期复发组与既往报道的T细胞富集型HCC及其他癌种中新辅助抗PD-1治疗的观察结果一致。

该组中PD-1⁺CD8⁺ Tex细胞治疗后激活和细胞毒性增强。

相比早期复发组，T型晚期复发组中预先存在的循环PD-1⁺CD8⁺ Tex细胞比例更高，提示更好的T细胞记忆/储备。

高T细胞扩增早期复发组中CD8⁺ Tex细胞表现为组织驻留表型且细胞毒性较差，提示T细胞质量而非仅数量决定疗效。

B型晚期复发的特征——TLS与B细胞激活

B型晚期复发组肿瘤中TLS数量显著高于早期复发组，提示抗PD-1治疗促进TLS形成（在小鼠模型中证实）。

抗PD-1治疗后，B型晚期复发组中B细胞主要分化为晚期B细胞（浆细胞），而早期复发组主要分化为中期B细胞（记忆细胞）。

浆细胞中IgG1亚型占绝对优势，且多重免疫组化证实IgG⁺CD138⁺浆细胞在B型晚期复发组中富集。

观察到IgG包被的肿瘤细胞，提示浆细胞产生的抗体直接结合肿瘤细胞。

B型晚期复发组中浆细胞BCR克隆扩增显著升高，表明抗原驱动的特异性体液免疫应答。

Tfh细胞在B型晚期复发中的核心作用

Tfh细胞比例与浆细胞比例呈最强正相关，是B细胞应答的关键调控者。

B型晚期复发组中Tfh细胞治疗后共刺激评分显著升高，功能更活跃。

原位检测发现TLS内存在增殖性Tfh细胞，且在B型晚期复发患者的TLS中富集。

PD-1⁺ Tfh细胞通过CXCL13-CXCR3和CD40-CD40LG通路与记忆B细胞和浆细胞强烈互作。

TLS区域内T-B细胞相互作用（TCR-MHCII、CD40-CD40LG）显著强于非TLS区域，支持TLS内活跃的T-B协同免疫应答。

核心结论

晚期复发患者对PD-1阻断的应答通过两条不同途径实现：T型依赖CD8⁺ Tex细胞直接杀伤肿瘤；B型依赖PD-1⁺ Tfh细胞→促进TLS形成→激活B细胞/浆细胞→产生抗体的间接抗肿瘤途径。

B型应答机制拓展了对抗PD-1治疗的认知，提示除经典T细胞途径外，B细胞/体液免疫在HCC免疫治疗中发挥重要甚至关键作用。

结果3、B型晚期复发患者中抗HBcAg应答增强

APR-mAbs的鉴定：从所有17例患者中鉴定出抗PD-1治疗后克隆扩增的BCR/抗体（APR-mAbs），其中B型晚期复发组中表达APR-mAb的浆细胞/B细胞比例最高。APR-mAbs的主要同种型为IgG1、IgM、IgG2、IgA和IgG3。

抗体筛选与抗原特异性：从三组中共鉴定出814种含体细胞高频突变且发生同种型转换的抗体，体外生成了208种单克隆抗体进行检测。结果显示，APR-mAbs主要针对HBcAg（23%结合率），而非HBeAg（2%）或HBsAg（1%）。

B型晚期复发组特异性富集HBcAg反应性抗体：B型晚期复发组中38.9%的APR-mAbs为HBcAg反应性，而T型晚期复发组和早期复发组分别仅为10.5%和12.3%。HBcAg反应性APR-mAbs对HBcAg具有高结合亲和力（KD低至4.17 pmol），且结合具有特异性。

HBcAg特异性B细胞主要定位于肿瘤局部：绝大多数HBcAg特异性BCR（95.7%）为肿瘤特异性，仅少数与血液共享（4.35%），肿瘤与癌旁肝组织之间未检测到共享的HBcAg特异性APR-mAbs。HBcAg反应性浆细胞高表达免疫球蛋白基因，富集体液免疫相关功能通路。

HBcAg反应性B细胞预先存在于肿瘤中：在未接受抗PD-1治疗的“单纯手术”队列中，同样检测到HBcAg反应性抗体（8.2%），证实HBcAg反应性BCR存在于肿瘤内是HBV相关HCC的固有病理特征。但该队列中晚期复发与早期复发之间无差异。

抗PD-1治疗“解除”局部抗HBcAg免疫：TALENT队列中B型晚期复发组HBcAg反应性抗体显著富集（而单纯手术队列中无此差异），提示抗PD-1治疗激活了肿瘤内预先存在但被抑制的抗HBcAg体液免疫。

局部而非系统性应答：血清HBV抗原及抗体水平在各组之间及治疗前后均无差异，排除系统性病毒再激活或系统性免疫应答升高，证明该抗HBcAg应答为肿瘤局部现象。

结论：B型晚期复发HCC患者中，抗PD-1治疗通过激活肿瘤局部预先存在的抗HBcAg体液免疫（B细胞/浆细胞产生特异性抗体）发挥抗肿瘤作用，TLS为其提供了关键的免疫微环境支撑。

结果4、SHM促进TLS内原位抗体结合HBcAg的可视化

技术方法创新：开发了结合空间Stereo-seq、SMRT-seq和体外抗体克隆表达的多技术联用方法，可同时追踪HBcAg特异性BCR的空间位置、克隆扩增、突变状态及抗原结合能力，实现原位“空间系统发育树”的构建。

HBcAg反应性BCR的细胞来源：从空间数据集中鉴定出19个HBcAg反应性BCR克隆（27种抗体），主要由浆细胞表达（88.6%），少数由记忆B细胞（8.6%）、初始B细胞（2.5%）和生发中心B细胞（0.3%）表达。

TLS内局部抗体应答：在TLS内部及周围均发现表达相同BCR克隆的浆细胞，表明肿瘤微环境内存在针对HBcAg的局部抗体应答。

空间系统发育树的构建与发现：在4个TLS内构建了11个BCR系统发育树，发现从胚系到下游谱系各节点均存在BCR突变，且在TLS内外均存在克隆扩增的BCR克隆。

SHM增强HBcAg结合能力：与胚系序列相比，84.3%的突变型BCR对HBcAg的结合能力增强，仅15.7%结合能力降低。该发现在TALENT队列外的独立患者TLS中进一步验证（90%增强，10%降低）。

Tfh细胞参与抗HBc应答：TLS内的增殖性Tfh细胞对HBcAg的结合潜力显著高于TLS外Tfh细胞，且扩增的Tfh克隆对HBcAg表位的预测结合亲和力更强。

T-B细胞协作：TLS内观察到Tfh细胞与HBcAg特异性B细胞的共定位，支持TLS作为T-B协同免疫应答的功能枢纽。

抗肿瘤效应证据：TLS邻近区域的肿瘤细胞凋亡评分显著高于远离TLS的区域，提示局部抗HBc免疫应答具有抗肿瘤活性。

结论：TLS为HBcAg特异性B细胞的体细胞高频突变（SHM）和亲和力成熟提供了关键的微环境，Tfh细胞在其中发挥辅助作用，最终产生高亲和力抗HBcAg抗体，参与局部抗肿瘤免疫应答。

结果5、细胞外HBcAg是可切除HBV相关HCC的肿瘤标志物

HBcAg在HCC肿瘤中的异常定位

HBcAg传统上定位于细胞质和细胞核，细胞外形式在正常肝组织中几乎检测不到。

与配对癌旁肝组织相比，HCC肿瘤中HBcAg表达（特别是细胞质表达）显著升高，而HBsAg在肿瘤与癌旁之间无差异。

B型晚期复发组和T型晚期复发组的HBcAg表达有高于早期复发组的趋势。

HBV DNA和cccDNA水平在各组间无差异，但B型晚期复发组的HBcAg mRNA表达略高，提示存在不同的转录/翻译调控机制。

细胞外HBcAg的直接证据

免疫透射电子显微镜（IEM）证实HCC肿瘤中存在细胞外/细胞间间隙的HBcAg阳性信号，且肿瘤中的细胞外和细胞内HBcAg信号均显著高于癌旁组织。

偶尔观察到膜结合HBcAg。HBcAg带强正电荷（富含精氨酸结构域），可吸附于带负电荷的肿瘤细胞膜表面，且可被生理盐水洗脱（非跨膜整合）。

细胞外HBcAg可能是从肿瘤细胞分泌并附着于周围，可作为联合抗PD-1治疗的潜在分子靶点。

HBcAg分泌的分子机制

已鉴定出促进裸露HBcAg分泌的基因：PDCD6IP（Alix）、HGS和ATG5/12/16L1（自噬相关）。

在HCC肿瘤细胞中，这些基因的mRNA表达显著高于周围肝细胞（基于两个独立数据集）。

siRNA沉默实验证实，敲低PDCD6IP、HGS或ATG5/12/16L1可显著抑制肝癌细胞上清液中的HBcAg，证明分泌通过Alix/HGS/ATG16L1介导的途径进行。

补体激活——B型晚期复发的关键效应机制

抗PD-1治疗后，补体相关基因表达仅在B型晚期复发组中显著升高。

B型晚期复发组中C3/C5基因表达与癌细胞死亡相关基因呈正相关（T型和早期复发组无此相关性）。

B型晚期复发组肿瘤组织中C5蛋白、活化C3a蛋白和C5b-9复合物沉积显著高于早期复发组，证实补体级联被激活。

机制链：HBcAg-APR-mAbs形成免疫复合物 → 触发经典补体通路 → 补体介导的肿瘤细胞杀伤。

补体活化的局部性

与正常肝细胞相比，HCC癌细胞中补体抑制剂（如CD59）和受体表达更低，而补体激活组分表达更高。

肿瘤组织中CD59蛋白低于肝组织，使肿瘤细胞对补体攻击更敏感。

补体活化效应局限于肿瘤局部，不会扩展至邻近肝组织或全身循环，避免系统性损伤。

潜在的临床转化意义——HBV相关B细胞特征评分

筛选并定义了HBV相关B细胞标志基因集，在B型晚期复发组中显著激活。

在发现队列和验证队列中，免疫治疗应答者的HBV相关B细胞特征评分均显著高于非应答者。

该特征评分在区分应答者与非应答者方面具有高准确性，可作为预测HBV相关HCC患者ICB治疗获益的潜在生物标志物。

结论

HBV相关HCC肿瘤中HBcAg异常表达并释放至细胞外空间，通过Alix/HGS/ATG16L1途径分泌。

抗PD-1治疗激活TLS内B细胞产生高亲和力抗HBcAg抗体，与细胞外HBcAg形成免疫复合物，在局部激活补体级联反应，杀伤肿瘤细胞。

补体活性局限于肿瘤局部（因癌细胞低表达补体抑制剂），避免系统性损伤。

HBV相关B细胞特征评分有望成为指导HBV相关HCC免疫治疗的临床生物标志物。

结果6、HBcAg-APR-mAbs在体内控制HBV相关肝脏肿瘤生长

HBcAg特异性抗体的体内抗肿瘤验证

从B型晚期复发患者肿瘤中克隆获得高亲和力抗HBcAg单抗mAb40，在HBcAg阳性Hepa1-6小鼠肝癌模型中验证其功能。

小鼠肿瘤组织中观察到细胞间和细胞外HBcAg，重现了人HCC的特征。

mIgG2a-mAb40（补体活性型）单药显著抑制肿瘤生长，增加肿瘤凋亡、减少增殖。

mIgG2a-mAb40联合抗PD-1的疗效显著优于抗PD-1单药，表明抗体可增强抗PD-1的抗肿瘤活性。

mIgG2a-mAb40治疗后补体C5沉积增加，巨噬细胞和T细胞浸润增强，联合抗PD-1后进一步增强。

HBcAg特异性抗体的抗原依赖性

抗PD-1治疗在小鼠模型中促进TLS形成，提示其可诱导局部抗肿瘤抗体产生。

mIgG2a-mAb40对HBcAg阴性的HCC肿瘤无抑制作用，也不能增强抗PD-1疗效，证明抗体的抗肿瘤作用严格依赖于肿瘤内HBcAg抗原的存在。

在HBcAg过表达的Hep53.4模型中验证了相同结果，进一步确认抗原依赖性。

补体依赖性——同种型实验

将mAb40转换为补体失能型（mIgG1-mAb40）后，完全丧失体内抗肿瘤活性。

证明HBcAg-APR-mAbs的抗肿瘤作用依赖其补体激活能力，而非单纯抗原结合。

补体依赖性——C1q基因敲除实验

在C1q KO小鼠中，mIgG2a-mAb40完全丧失抗肿瘤活性，证明补体C1q是抗体发挥作用的必要因子。

抗PD-1的疗效在C1q KO小鼠中保持不变，表明T细胞通路不依赖补体。

C1q KO小鼠较野生型小鼠有更高的基线免疫浸润和延迟的肿瘤生长，但不影响治疗反应的差异格局。

核心结论

HBcAg特异性抗体通过补体C1q依赖性方式在体内发挥抗肿瘤作用。

抗体联合抗PD-1可进一步增强抗肿瘤疗效，机制可能涉及补体沉积增加及免疫细胞浸润增强。

该效应严格依赖于肿瘤细胞表达和分泌HBcAg，提示细胞外HBcAg可作为抗体治疗的理想靶点。

为HBV相关HCC的联合治疗策略（抗PD-1 + 抗HBcAg抗体）提供了临床前实验依据。

最后来看看方法，Stereo-seq

生活很好，有你更好。