课前准备（visium HD）--结直肠癌宏观与微观转移的空间多组学景观

作者，Evil Genius

现在的天气真的是太热了。

大家如果有能力，最好掌握基因组 + 单细胞空间 + 分子对接/分子动力学，基因组 + 单细胞空间在于发现生物学问题，分子对接/分子动力学在于为生物学问题提供一个可能的解决方案，这样一套完整的逻辑是审稿人非常喜欢的。

我们2026年空间转录组系列课程正处于visium HD（Stereo-seq）的教学部分，目前HD的文章发表了50多篇，已经非常具有借鉴意义，华大的分析思路也在逐步完善，大家做了HD或者stereo-seq要趁着这个“风口”，好好分析一下，把文章投出去，千万别跟单细胞一样，错过18-20年，纯单细胞就很难发文章了，现在单细胞文章不仅需要多组学，样本量的要求也是非常高的。

今日借鉴文章如下，不得不说，有平台 + 只靠实力说话，国人简直是无敌的。

知识积累

结直肠癌（CRC）转移常因治疗后微小残留病灶（MRD）和持续性微转移而导致复发。

肝微转移（CLiMi）源于早期克隆分化，并呈现出类似于转移性休眠的干性、静止状态。在空间层面，发现了不同的基质屏障：大转移灶被肌成纤维细胞包裹，而微转移灶则被以T细胞耗竭和独特配体-受体信号网络为特征的免疫抑制微环境所包围。

研究背景：CRC转移是影响生存的主要障碍，MRD是复发前兆，但组织层面的MRD标志物尚不明确。CLiMi（肝微转移）是潜在的MRD组织替代物。

研究空白：现有单细胞研究缺乏空间维度，空间组学研究样本量小、覆盖面窄，未能充分揭示转移和MRD的空间细胞复杂性。

研究方法：对49个肿瘤标本（含配对原发灶、肝/肺转移）进行空间多组学分析（Visium ST、Visium HD ST、LCM-WGS、超高多重蛋白成像），分析数十万个空间位点。

主要发现：鉴定了肝和肺微转移部位特异性的转录组改变和生物学程序；发现并验证了一个CLiMi特异性基因特征。

临床意义：该基因特征可预测MRD无复发生存、无病生存和化疗耐药性，具有重要的转化应用潜力。

结果1、CLiM、CLuM 及原发性 CRC 的研究队列与组织学特征

数据队列

患者来源：共纳入19例结直肠癌（CRC）患者。

样本类型：包括配对的原发性CRC、肝转移（CLiM）和肺转移（CLuM），同时涵盖大转移（macro）和微转移（micro）病灶。

多组学数据平台及样本数量

宏观与微转移的病理分类及验证

病灶数量：

肝大转移（CLiMa）：27个病灶

肝微转移（CLiMi）：47个病灶

肺大转移（CLuMa）：4个病灶

肺微转移（CLuMi）：6个病灶

原发性CRC：12个病灶

分类验证：

基于转录组和病灶物理大小，使用k-means和高斯混合模型（GMM）进行无监督聚类。

Visium数据中，k-means仅误分2个大转移，GMM仅误分1个。

Visium HD数据中，分类准确率达100%（10/10），证明分类策略可靠。

病理学注释分层体系

注释方式：两位病理学家独立标注H&E图像上的每个Visium斑点，不一致处经协商达成共识。

质量控制后纳入分析的斑点总数：341,328个（直径55 μm）。

三层注释结构：

研究目的:通过整合病理学注释、组织结构和基因表达谱，进一步刻画CLiM、CLuM和原发性CRC组织中克隆结构、转录组程序和信号通路活性的空间动态变化。

结果2、CLiM、CLuM 及原发性 CRC 中异质的克隆结构与演化模式

研究目的与方法

为绘制CRC原发灶和转移灶中肿瘤细胞富集区域的空间克隆结构，研究人员从Visium ST数据中推断拷贝数变异（CNV），评估全基因组范围的染色体获得和缺失。

以非肿瘤斑点（"Normal"）作为参考对照，其未显示任何变异。

根据CNV谱相似的斑点可能具有共同起源的原理，构建系统发育树以定义肿瘤演化轨迹。

两位代表性患者（Pat1和Pat6）的克隆演化特征

Pat1（原发灶、肝转移、肺转移均匹配）：

所有部位的恶性细胞在多个染色体（如1p、3p、7、17、18、20）上共享主要CNV。

原发灶和肺转移的CNV谱高度相似，而肝转移的变异较少。

原发灶和肺转移优势克隆（C5–C6、C4）显示广泛的CNV，而肝转移优势克隆（C1–C3）变异较少。

肝大转移和肝微转移共享克隆C1，提示二者有共同起源。

CytoTRACE分析显示，肝转移和肺转移的分化程度低于原发灶。

Pat6：

原发灶（C5–C6）与肝转移（C7–C8）部分克隆重叠，在多个染色体（5、7、13、17、18、20）共享CNV。

两个肝转移样本克隆结构相似。

肺转移拥有独立的克隆（C1–C4），与原发灶和肝转移重叠有限，且CNV更广泛。

CytoTRACE显示肺转移中低分化细胞比例高于原发灶和肝转移。

空间分布特征：

Pat1中肝转移优势克隆在空间上分离但CNV谱相似，提示肝内存在平行演化。

Pat6及其他患者中也观察到原发灶、肝转移、肺转移样本间类似的空间分离现象。

结论：转移演化具有复杂性，患者间克隆动态存在异质性。

CNV推断结果的验证

为验证Visium推断的CNV模式，对6例代表性样本的相邻切片进行LCM-WGS（激光捕获显微切割+全基因组测序）正交验证。

结果显示，LCM-WGS获得的CNV图谱与Visium ST推断结果高度一致，证实了空间CNV推断的稳健性和准确性。

肝微转移（CLiMi）的特征——早期演化且具有干性

系统发育位置：

多位患者（Pat1、3–7、9–11）中，CLiMi均占据系统发育树的早期演化分支。

CNV负荷与细胞状态比较（CLiMi vs CLiMa）：

CLiMi的CNV评分更低。

CytoTRACE评分更低（提示分化程度更低/更原始）。

分化评分和静止评分更高。

总体表明CLiMi处于更原始、更静止的状态。

LCM-WGS验证：

对4对匹配的CLiMa-CLiMi进行MEDICC2系统发育重建和CNV分析，进一步证实CLiMi位于更早分支且CNV负荷更低。

免疫组化/免疫染色验证：

多重免疫染色显示，CLiMi中干性标志物SOX2的表达强度为中到强，高于CLiMa；而增殖标志物Ki-67在两组间无显著差异。

单重免疫组化进一步显示，结肠上皮干细胞标志物SOX9在CLiMi中的表达显著高于CLiMa。

结果3、CLiM、CLuM 及原发性 CRC 中保守与独特的空间元程序

空间元程序（MP）的鉴定方法

使用非负矩阵分解（NMF）将基因表达分解为生物学模块。

通过Jaccard距离和层次聚类评估程序相似性，将重叠程序归并为重现性模块。

每个聚类的共识标记基因定义为空间元程序（MP）。

各组织部位的MP组成

跨器官共有与部位特异的MP

共有MP（所有器官共享）：Mac_CD68、T_B/T_cell、TU_CEACAM5、myCAF、SMC、iCAF、Endo、TU_Cycling、炎症性/中性粒细胞、TU_SLC2A1。

部位特异性MP：其余MP为各器官特有。

结论：CRC转移中存在核心保守的转录程序，同时肿瘤和基质区室表现出器官特异性适应。

多组学整合验证策略

Visium ST的局限：单个斑点含混合细胞群体。

解决方案：整合PhenoCycler-Fusion超高多重蛋白成像和Visium HD ST，在单细胞蛋白和RNA水平验证发现。

IO60抗体panel覆盖关键免疫、基质和肿瘤标志物。

分析了9个CLiM、3个CLuM、5个原发性CRC样本的相邻切片。

转录组-蛋白质组一致性验证

CLiM中确认的MP-蛋白对应：TU_CEACAM5（EPCAM）、T/B细胞（CD20、CD3e）、巨噬细胞（CD68）、中性粒细胞（MPO）、myCAF（Collagen IV）、SMC（SMA）、内皮细胞（CD31）、肝细胞（iNOS）。

CLuM和原发性CRC中观察到类似模式。

结论：转录组与蛋白质组具有高度一致性。

Visium HD ST高分辨率验证

分析9个Visium HD样本（8个CLiM + 1个原发性CRC）+ 3个公共原发灶样本。

通过核分割和细胞重建，结合Harmony整合和标记基因注释。

鉴定细胞数量：CLiM中801,392个细胞（16种细胞类型），原发性CRC中545,885个细胞（17种细胞类型）。

Jaccard相似性分析显示Visium ST的MP与Visium HD的差异表达基因映射一致，支持跨平台高度一致性。

Visium HD的独特优势

能够鉴定稀有细胞类型：

CLiM中不同的肝细胞状态

原发性CRC中的肥大细胞和淋巴内皮细胞

突显了单细胞空间分辨率的显著提升。

结果4、原发性CRC中肿瘤细胞跨结肠壁层的代谢与信号适应

原发性CRC中肿瘤细胞跨结肠壁层的适应变化

分析层次：黏膜/黏膜下层 → 肌层 → 浆膜下层。

肿瘤相关MP变化：TU_CEACAM5随深度增加而升高；TU_stem_LGR5和TU_Cycling随深度下降。

TME相关MP变化：myCAF、Mac_CD68、Endo随肿瘤深度逐渐增加。

Mac_CD68表达促肿瘤巨噬细胞标志物（SPP1、TREM2）；myCAF富集ECM重塑基因（INHBA、THBS2、SPARC）。

跨层通路与代谢重编程

深层上调通路：EMT、TGF-β信号、血管生成、分化通路。

代谢转变：浅层的氧化磷酸化和柠檬酸循环 → 深层的糖酵解和缺氧相关通路（从富氧向缺氧适应转变）。

Visium HD ST单细胞分辨率数据一致验证了上述梯度。

HIF-1α免疫组化证实深层区域存在局部缺氧（核染色更强）。

结论：CRC跨层进展伴随协调的转录和代谢重编程，朝向缺氧适应和侵袭性表型。

微转移与大转移的TME差异（CLiM）

CLiMa（肝大转移）：富集肿瘤相关MP（TU_CEACAM5、TU_Cycling、TU_SLC2A1）和TME相关MP（myCAF、Mac_CD68）。

CLiMi（肝微转移）：相对富集淋巴细胞（T_B）和iCAF。

微转移与大转移的TME差异（CLuM）

CLuMa（肺大转移）：TU_CEACAM5和myCAF增加。

CLuMi（肺微转移）：T细胞和Mac_CD68比例较高。

微转移中的免疫抑制通路富集

CLiMi中上调通路（vs CLiMa）：CTLA-4信号、PD-1信号、IL-10信号、适应性免疫应答负调控、ROS解毒、苯丙氨酸代谢。

这些通路均为已知免疫抑制介质 → 提示微转移TME中存在T细胞功能障碍和免疫逃逸。

CLuMi中观察到类似趋势。

相反，WNT/β-catenin和Hedgehog信号在CLiMa/CLuMa中富集（与肿瘤生长维持相关）。

T细胞耗竭状态的验证

标准化分析（相对CD3D表达）：

耗竭标志物（PDCD1、CTLA4、LAG3、TIGIT）：CLiMi/CLuMi中升高。

细胞毒性标志物（GZMB、IFNG、TNF）：CLiMa/CLuMa中更高。

蛋白水平验证（PhenoCycler-Fusion成像）：微转移中PD-1⁺GZMB⁺ T细胞增加。

结论：微转移中耗竭T细胞更普遍，RNA和蛋白水平均一致。

免疫抑制分子与评分

免疫抑制分子（CD274、PDCD1LG2、FASLG、IL4I1、TGFB1等）在CLiMi/CLuMi中较匹配大转移显著上调。

免疫抑制评分：CLiMi/CLuMi持续高于CLiMa/CLuMa，空间定位显示主要定位于微转移区域。

敏感性分析（不同距离和大小阈值）证实分类稳健，关键生物学特征保持稳定。

核心结论

微转移尽管富集淋巴细胞，却表现出增强的T细胞耗竭和免疫抑制信号。

提示微转移中存在协调的免疫逃逸程序，可能为MRD持续存在的机制之一。

结果5、CLiM、CLuM 和原发性 CRC 中不同的空间结构

研究方法

使用邻域评分（周围斑点中某MP的占比）和邻近性评分（与其他MP区域的距离）两种指标。

基于这些指标构建跨组织的空间相互作用网络。

将MP分为肿瘤、肿瘤基质或正常三类，描绘TME调控结构。

跨组织的共同发现

Mac_CD68和myCAF是所有组织中最常邻近肿瘤区域的TME相关MP，与它们在肿瘤进展和免疫逃逸中的作用一致。

不同组织间MP空间模式的差异

cell2location共定位验证：

CLiM：TU_CEACAM5与Mac_CD68和myCAF共定位。

CLuM：TU_CEACAM5与T细胞密切相关。

原发性CRC：TU_CEACAM5主要与Mac_CD68邻接。

蛋白水平验证（PhenoCycler-Fusion成像）

手动对齐Visium ST与蛋白成像，证实了上述空间邻近关系。

功能标志物分析：

CLiM中myCAF（Collagen⁺）表达SMA和Vimentin（收缩性和ECM重塑活性）；巨噬细胞（CD68⁺）为M2表型（CD163⁺ iNOS⁻）。

CLuM中T细胞（CD3e⁺）表达耗竭标志物PD-1和TOX。

原发性CRC中巨噬细胞（CD68⁺）呈现M2表型（CD163⁺ iNOS⁻）。

配体-受体分析揭示的器官特异性相互作用

原发性CRC：TU_CEACAM5-巨噬细胞相互作用富集，通路包括CCL5–CCR1/5、CXCL16–CXCR6、CSF1–CSF1R、IL4–IL13RA1 → 促进巨噬细胞募集和M2样极化。

CLiM：TU_CEACAM5-myCAF相互作用为主，通路包括LAMC1/LAMB1/CDH1/FN1–整合素、COL4A–CD44、TNC–ITGB1 → 整合素通路促进胶原收缩和ECM重塑。

核心结论

原发性和转移性CRC具有不同的空间结构和细胞-细胞相互作用。

不同器官（肝vs肺）的转移灶呈现出器官特异性的TME组织模式，体现在基质细胞组成、免疫细胞分布和关键信号通路的差异上。

结果6、肌成纤维细胞CAF（myCAF）包裹大转移，而淋巴细胞环绕微转移

研究所有CLiM和CLuM样本中大转移与微转移之间MP空间分布的差异，将肿瘤区域向外扩展三个斑点层，并进行邻域和邻近性分析。

研究方法

将肿瘤区域向外扩展三个斑点层。

进行邻域分析和邻近性分析，比较微转移与大转移中MP的空间分布差异。

CLiM中大转移与微转移的MP空间关系差异

CLiMi（肝微转移） ：T_B细胞在TU_CEACAM5周围具有更高的邻近性和邻域富集 → 肿瘤细胞与淋巴细胞密切关联。

CLiMa（肝大转移） ：myCAF在TU_CEACAM5邻近和邻域中空间富集 → 肿瘤细胞被基质myCAF包围。

CLuM（肺转移） 中观察到相似模式，证实该现象跨转移器官保守。

空间共定位的可视化验证

微转移区域：TU_CEACAM5与T_B空间共定位。

大转移区域：TU_CEACAM5与myCAF空间共定位。

在多个样本中一致观察到该模式。

蛋白水平验证（PhenoCycler-Fusion成像）

CLiMa：TU_CEACAM5与myCAF明确共定位。

CLiMi：TU_CEACAM5与T细胞明确共定位。

功能标志物分析：

CLiMa中myCAF（Collagen IV⁺） ：表达SMA和Vimentin → 具有ECM重塑活性。

CLiMi中T细胞（CD3e⁺） ：表达耗竭标志物PD-1和TOX → 处于耗竭状态，活化受损。

配体-受体分析揭示的区域特异性相互作用

CLiMa（TU_CEACAM5–myCAF） ：通路包括LAMA3/A4/B3/C2–整合素、COL4A1–CD44、TNC–ITGB1 → 促进胶原收缩和ECM重塑。

CLiMi（TU_CEACAM5–T细胞） ：通路包括PGE2/PTGES2–PTGER4、NECTIN2/3–TIGIT、PVR–TIGIT、CD274–PDCD1 → 可能导致T细胞耗竭和抗肿瘤免疫抑制。

核心结论

微转移与大转移具有显著不同的空间组成和TME相互作用模式：

微转移：更常被免疫细胞（淋巴细胞） 包围，但这些T细胞处于耗竭状态。

大转移：更密集地被基质myCAF包裹，形成物理屏障并重塑ECM。

两种模式分别通过不同的配体-受体信号通路介导，反映了截然不同的免疫逃逸和肿瘤维持策略。

结果7、CLiMi特异性基因与肿瘤细胞亚群的鉴定

六基因特征的鉴定

筛选策略：DEG分析比较CLiMi vs CLiMa vs 正常肝实质 → 初步获109个基因（倍数变化>2，>30%斑点表达）→ 进一步过滤CLiMi特异性富集 → Visium HD ST中Wilcoxon检验选最高表达基因。

最终六个基因：BCL7B、COX17、RNF40、YME1L1、WEE1、AEN。

验证：Visium和Visium HD ST中该特征均在CLiMi病灶中特异性富集。

单细胞水平验证——MicroMetSig^hi肿瘤细胞亚群

内部scRNA-seq数据（4个CLiM样本，含配对CLiMa和CLiMi）：

聚类发现独特肿瘤细胞亚群，协调高表达上述六个基因，定义为MicroMetSig^hi簇。

公共数据集整合验证（scANVI，GSE231559 + GSE225857）：

保守的恶性亚群，覆盖MDACC中大部分MicroMetSig^hi细胞。

通路特征：富集干性（SOX2/SOX9↑）、静止程序及免疫抑制通路（IL-4信号、适应性免疫负调控）。

RNA速率分析：MicroMetSig^hi细胞处于肿瘤细胞轨迹的早期状态（与LCM-WGS演化层级一致）。

结论：CLiMa中存在独特的恶性细胞状态，特征为干性样、静止、免疫抑制，可能促进微转移播种和治疗耐药。

六基因特征的临床预后价值（MDACC内部队列，n=117）

高表达与较差DFS显著相关（p=0.042）。

高表达与较差MRD-FS显著相关（p=0.031）。

多变量Cox回归：六基因特征为DFS（HR=1.48，p=0.023）和MRD-FS（HR=1.65，p=0.046）的独立预测因子。

复发患者六基因评分显著高于未复发患者。

六基因特征与治疗耐药

比较基线与化疗后复发CLiM：

复发CLiM中六基因评分显著升高。

去卷积分析显示复发CLiM中MicroMetSig^hi细胞比例增加。

公共数据集验证（GSE285991 scRNA-seq + GSE131418 bulk RNA-seq）：

化疗后和治疗耐药样本（包括PD病例）中特征评分升高。

结论：六基因特征富集与化疗耐药相关。

六基因特征在原发性CRC中的预后价值

GSE21510（n=146）：发生转移的肿瘤六基因评分显著高于未转移肿瘤。

TCGA（n=610）：高表达与较短DFS相关（p=0.004）。

GSE17538（n=232）：高表达与较短DFS相关（p=0.043）。

OS趋势：两个队列中高表达均显示较差OS趋势（p=0.082和p=0.17）。

核心结论

CLiMi六基因特征（BCL7B、COX17、RNF40、YME1L1、WEE1、AEN）是稳健且可重复的生物标志物。

该特征与MRD状态、复发风险、化疗耐药和不良生存结局密切相关。

其背后的MicroMetSig^hi肿瘤细胞亚群具有干性、静止和免疫抑制特性，可能驱动微转移形成和治疗抵抗。

最后，来看看方法

数据质控

visium HD细胞分割

空间邻域通讯

生活很好，有你更好。