课前准备--空间组学解析肿瘤异质性

作者，Evil Genius

2026年空间转录组系列课程已经在进行中，各位学员上完课程后，课程上提到的文献一定要亲自看一看，提供给大家的脚本亲自做一做，遇到问题群里随时答疑。

今天我们来汇总一些空间平台解析肿瘤内部异质性。

核心问题：肿瘤内异质性 (ITH)

定义：单个肿瘤内存在多种多样的癌细胞状态、基因型和微环境生态位。

重要性：是治疗耐药和疾病进展的主要驱动因素。

本质：肿瘤是长期进化、突变累积和克隆选择的结果；是一个包含癌细胞、免疫细胞和基质细胞的动态、可塑的生态系统。

技术演进

古典病理学：首次发现组织学异质性。

DNA测序：提供分子层面的ITH见解，揭示克隆性肿瘤发生。

单细胞基因组学：以前所未有的粒度识别新细胞亚型和状态。

局限性： 这些方法需要组织解离，丢失了关键的空间位置信息。

解决方案：空间生物学的出现，因为细胞行为受空间组织控制。

空间蛋白质组学 (SP)

原理： 基于抗体检测（类似IHC/IF），但具备高度多重检测能力（可同时检测50-100个标记物）。

三大类别：

多重IHC (mIHC)：

方法：连续染色、成像、抗体剥离/失活循环（如MICSSS）。

优势：使用标准明场显微镜，兼容FFPE组织。

局限：循环次数有限（~20轮）。

多重IF (mIF)：

方法：

循环法：迭代染色、成像、失活（如CyCIF, t-CyCIF, IBEX, seqIF, MACSima）。

一次性法：使用DNA条形码抗体，通过多轮杂交和成像解码（如CODEX）。

优势：单细胞分辨率，更好的多重能力（40-100+蛋白）。

仪器示例：CODEX, Cell DIVE, PhenoCycler, Orion, MACSima, COMET。

基于质谱 (MS)：

方法：使用金属同位素标签，通过质谱检测（如IMC）或离子束成像（如MIBI）。

优势：无光谱重叠，背景低，高分辨率。

局限：仪器昂贵且需专业知识，扫描面积/速度有限，通常需要冷冻或固定冷冻组织（IMC/MIBI I）。

选择依据： 取决于实验需求、组织类型（FFPE vs 冷冻）、预算、通量和分辨率要求。

空间转录组学 (ST)

核心挑战： 在检测RNA的同时保留其空间位置信息（RNA测序通常需要组织裂解）。

四大类别：

显微切割/ROI-based (基于感兴趣区域)：

方法：使用激光或光控技术分离特定区域RNA（如GeoMx DSP, Light-seq, ZipSeq, TIVA, PIC）。

特点：非单细胞分辨率，提供选定区域内的全转录组或靶向数据。

基于荧光原位杂交 (FISH)：

方法：使用多轮荧光探针杂交、成像和剥离来解码RNA（如seqFISH, MERFISH）。

商业平台：Vizgen MERSCOPE (MERFISH), Nanostring CosMx (smFISH)。

特点：真正的单细胞/亚细胞分辨率，灵敏度高，但基因数量受光学拥挤限制（目前~1000-6000个基因）。需要预选基因组合。

新方法：RAEFISH 通过RCA扩增，实现全转录组覆盖，但灵敏度可能有折衷；PRISM 利用强度区分条形码，降低设备要求。

基于原位测序 (ISS)：

方法：在组织原位对RNA进行测序（如STARmap, BaristaSeq, ExSeq, FISSEQ, Xenium）。

特点：直接读取序列信息，单细胞/亚细胞分辨率，但同样受光学拥挤影响，基因通量有限。

基于空间条形码 (Spatial Barcoding)：

方法：使用带有位置条形码的探针阵列捕获mRNA，通过测序将转录本映射回空间位置（如Visium, Slide-seq, HDST, Stereo-seq, DBiT-seq）。

商业平台：10x Genomics Visium。

特点：全转录组覆盖，流程与现有测序兼容，无需专用成像设备。但非单细胞分辨率（每个点可能包含多个细胞），最新版本（Visium HD）接近单细胞。

空间功能基因组学

目的： 将基因型（扰动）与表型（空间位置）直接关联，实现反向遗传学（从基因到功能）。

方法： 结合CRISPR筛选与空间读数。

基于蛋白质读数 (SP-readout)：

使用蛋白条形码（如Pro-Codes, EpicTag, EPICode）标记携带特定sgRNA的细胞。

通过抗体染色检测条形码和表型标记物。

关键方法：Perturb-map。应用：发现TGFBR2缺失、IL-4、CCL7、PAI1/2等基因在肿瘤微环境重塑和免疫逃逸中的作用。

基于转录组读数 (ST-readout)：

在ST平台上直接检测sgRNA或扰动引起的转录组变化。

关键方法： Perturb-FISH (MERFISH), Perturb-Multi (CROPseq-multi + MERFISH/ISS), CRISPRmap (seqFISH), PerturbView (ISS), Perturb-CAST (Visium), Perturb-DBiT (DBiT-seq)。

空间克隆追踪

目的： 重建肿瘤内不同克隆谱系的进化历史和空间分布。

方法类别：

利用内源性体细胞突变：

方法：显微切割+测序，Slide-DNA-seq，Slide-tags。

优势：适用于人类临床样本（无需工程改造）。

特点：Slide-tags可实现单细胞核分辨率的空间转录组/表观基因组分析。

利用工程化条形码：

整合酶系统 (intMEMOIR)： 通过DNA重组记录谱系，可结合FISH。

慢病毒条形码 (TREX, SpaceBar)： 随机序列标记细胞，可结合ST。

利用CRISPR诱导的“疤痕”：

原理：诱导Cas9在条形码上产生随机突变（插入/缺失），形成独特标识。

方法：scGESTALT, ScarTrace, LINNAEUS, macsGESTALT, iTracer, Zombie。

关键应用 (macsGESTALT)： 在胰腺癌中发现，大多数克隆不转移，而获得杂交EMT状态和表达S100基因的罕见克隆具有转移能力。

综合模型： 如KP-Tracer（结合CRISPR疤痕和ST），用于研究肺癌进展中的空间群落和克隆动态。

整合多组学与计算挑战

多模态整合： 结合SP、ST、功能基因组学、克隆追踪以及表观基因组学、代谢组学是未来方向。

新兴技术： spatial-CITE-seq (RNA+蛋白), SPOTS (RNA+蛋白), 空间表观-转录组共测序等。

计算挑战：

数据稀疏性、高噪声、平台间批次效应。

细胞分割（识别细胞边界）困难。

数据整合和空间统计分析复杂。

解决方案：

开发和使用开放、可扩展的分析框架：SquidPy, SCIMAP, Giotto, SpatialData, Seurat。

人工智能（AI）的应用：加速模式识别、数据插补、从H&E染色预测ST数据。

临床转化与未来展望

当前临床生物标志物局限： 常规IHC（如PD-L1）预测免疫治疗反应的能力有限。

空间生物标志物的潜力：

巨噬细胞PD-L1表达比肿瘤细胞PD-L1更能预测ICI反应。

特定的免疫细胞三合会（如CXCL13+ Th, PD-1hi 祖CD8 T, 成熟DCs）与治疗响应相关。

特定的细胞空间邻近性与患者生存相关。

特定巨噬细胞状态（IL4I1+ 有利；SPP1+ 不利）和三级淋巴结构（TLS）是重要的预后/预测指标。

临床转化的挑战：

成本：仪器和试剂昂贵。

基础设施：需要大规模数据存储和计算能力。

专业知识：缺乏生物信息学专业人才。

技术权衡：通量与分辨率之间的矛盾。

标准化：不同平台和实验室间的方案和结果需要统一。

未来方向：

技术将更便宜、更易用、分辨率更高。

与AI的深度融合，将加速基础研究和临床诊断。

有望在未来临床实践中，通过AI分析H&E染色结合低多重空间蛋白检测来指导治疗。

生活很好，有你更好。