课前准备--利用组织病理学进行细胞结构建模及邻域信息引导的虚拟空间肿瘤特征分析

作者，Evil Genius

今天我们正式上课，2026年空间转录组系列课程我们就开始了。

无论哪种空间平台的数据分析，细胞邻域（细胞微环境）都是分析的重点。

今日参考文献

知识积累

肿瘤微环境（TME）是癌症进展和治疗响应的关键决定因素。

TME中多种细胞在空间上组织成“生态栖息地”，与预后和免疫治疗反应密切相关。

基础数据：构建了10种可重复的细胞邻域（CNs）分类体系，代表肿瘤、免疫和基质细胞的空间组织模式。

结果1、从空间角度解析非小细胞肺癌（NSCLC）不同组织学亚型的免疫和基质细胞组成差异

对457例NSCLC患者样本进行41重CODEX高维空间蛋白质组学成像，包含2个组织微阵列（TMA）队列和10张全切片，并配有同一组织切片的H&E染色对照。

使用41种抗体标记细胞谱系和功能标志物，将细胞分为上皮、淋巴、髓系、基质四大类，并进一步细分功能状态（如增殖、干性、缺氧、抗原呈递、免疫检查点活性等）。

对337例TMA队列1样本进行无监督谱系分类，识别出除肿瘤上皮细胞外的14种微环境细胞群体。

整体细胞构成：内皮细胞（10.4%）是非上皮细胞中最多的，其次为T辅助细胞（9.6%）、癌症相关成纤维细胞（8.2%）和中性粒细胞（6.5%）。

LUAD vs. LUSC的差异

免疫细胞浸润在肺鳞状细胞癌（LUSC）中略高于肺腺癌（LUAD）（43.7% vs. 37.8%），主要源于髓系细胞比例更高（21.8% vs. 14.8%），而淋巴和基质组分两者相似。

单细胞层面：LUSC富集中性粒细胞和M2型巨噬细胞；LUAD富集T辅助细胞、浆细胞、平滑肌细胞和树突状细胞。

组织学亚型内部分析

LUAD中，从贴壁型向实体型进展时，淋巴谱系增加；LUSC各亚型间主要TME组分变化不大。

LUSC角化亚型中，癌症相关成纤维细胞显著扩增，B细胞减少。

LUAD随着组织学分级升高，适应性免疫组分增加（包括细胞毒性T细胞、B细胞、调节性T细胞）。

结果2、空间拓扑塑造肺癌中的免疫调节结构

一、TME组成与临床病理特征的关联

将细胞比例与患者临床数据（人口学特征、肿瘤特征、分子改变、组织学亚型、生存结局）整合分析。

LUSC（肺鳞癌）中：晚期肿瘤、有脉管或胸膜侵犯者，肿瘤细胞更富集；而早期无侵犯者富集细胞毒性T细胞（Tc）、T辅助细胞（Th）和自然杀伤细胞（NK），提示存在细胞毒性免疫浸润微环境。癌症相关成纤维细胞（CAFs）在角化型鳞癌中选择性扩增，提示基质驱动鳞状上皮分化。

LUAD（肺腺癌）中：Tc和Th细胞富集于实体为主型、早期、较小肿瘤中，提示活跃的适应性免疫景观，且与良好预后相关。低分化肿瘤中，中性粒细胞和M2巨噬细胞富集于高侵袭性亚组，与促肿瘤炎症和免疫抑制重塑一致。

但TME组成特征与预后的关联有限，提示更高阶的空间关系可能在肿瘤进展中发挥重要作用。

二、空间拓扑结构塑造肺癌免疫调节架构

通过置换检验量化细胞间成对空间相互作用，并结合样本水平共现分析。

LUAD中：肿瘤细胞与Tc、Th细胞空间隔离（细胞毒性接触受限）；中性粒细胞靠近M2和内皮细胞（ECs），形成与免疫抑制和血管生成相关的互作模式。

LUSC中：Tc和Th细胞更常靠近基质和髓系成分（CAFs、M2、ECs），提示免疫效应细胞被重新分布，远离肿瘤细胞。

三、组织学进展中的细胞间网络演变

LUAD高级别型（微乳头和实体型）：肿瘤细胞与中性粒细胞、ECs、M1巨噬细胞、B细胞的互作增强，同时肿瘤-Tc互作减弱（尽管Tc细胞数量增加）。中性粒细胞、ECs与肿瘤细胞的空间接近提示存在促转移的“血管门户”。

LUSC高级别（非角化型）：M2与T淋巴细胞、NK细胞的空间互作增强，提示形成免疫抑制生态位。

LUSC角化型：呈现纤维化排斥样结构，CAFs与Tc、Th、B、NK细胞空间相邻；ECs与M2、CAFs、B系细胞共现，可能形成血管周围排斥区，减少T细胞浸润。

四、高阶空间拓扑与预后相关三细胞基序

使用图神经网络（GNN）分析细胞-细胞空间图，发现一个保守的免疫调节中枢，包含肿瘤细胞、Tc、Th、M2、CAFs、ECs、中性粒细胞。

通过枚举三细胞基序，识别出24个拓扑富集的三联体，其中12个与患者预后显著相关。

高风险基序：以肿瘤相关髓系和基质三联体为主（如M2-肿瘤-CAF、中性粒细胞-肿瘤-CAF），反映纤维炎症性免疫抑制轴。

保护性基序：包含效应淋巴细胞和ECs（如Tc-肿瘤-Th、EC-肿瘤-B），支持细胞毒性杀伤和血管可及性。

核心结论

NSCLC的进展沿两条相互关联的轴线发生：一条由细胞组成变化驱动，另一条由细胞间相互作用形成的免疫调节回路维持。

这些空间拓扑架构在不同组织学亚型中高度保守，提示存在一个统一的、将肿瘤进展与空间协调的免疫调节相结合的结构框架。

单细胞空间分析对于揭示TME基本生物学规律至关重要。

结果3、细胞邻域（CNs）构成肺癌中具有预后意义的生态单位

一、细胞邻域（CNs）的定义与分类

通过无监督聚类算法，在固定半径内聚集已标注谱系的细胞，定义了10种细胞邻域（CNs），代表了肿瘤组织的典型生态单位：

CN01：肿瘤核心

CN02：巨噬细胞富集区

CN03：B细胞生态位

CN04：基质纤维化区

CN05：浆细胞簇

CN06：中性粒细胞富集区

CN07：肿瘤-免疫界面

CN08：T细胞区

CN09：泛免疫激活区

CN10：血管生态位

二、CNs的临床预后关联

不良预后相关：CN01（肿瘤核心）、CN04（基质纤维化）、CN06（中性粒细胞富集区）。

良好预后相关：CN03（B细胞）、CN05（浆细胞）、CN07（肿瘤-免疫界面）、CN08（T细胞区）。

这些关联在独立NSCLC队列中得到了验证，说明CNs在不同队列间具有一致性。

三、细胞状态解析的生态单位（CEUs）

在CNs基础上进一步细化到细胞表型状态，定义了CEUs（细胞状态解析的生态单位）。

促肿瘤/不良预后相关CEUs（CN01、CN04、CN06内）：

CN01：富集PanCK⁺肿瘤细胞、CD44⁺干性样亚群、Ki67⁺增殖细胞；E-cadherin⁺细胞代表保留上皮状态、EMT有限。

CN04：富集基质相关CAFs（mCAFs）和HIF1A⁺成纤维细胞，形成缺氧驱动的纤维化生态位。

CN06：富集Ki67⁺/HIF1A⁺活化中性粒细胞，提示缺氧环境下促肿瘤的中性粒细胞程序。

免疫活性/良好预后相关CEUs（CN03、CN08、CN10内）：

CN03：富集表达HLA-A/E和HLA-DR的B细胞，支持抗原呈递和体液免疫。

CN08：富集表达颗粒酶B（GZMB）的细胞毒性CD8⁺T细胞和CD4⁺T辅助细胞，体现持续的效应活性和适应性免疫激活。

四、CN07（肿瘤-免疫界面）的特殊性

该生态位同时具有促肿瘤和抗肿瘤特征，整合了CD8⁺T细胞（含GZMB⁺效应亚群）、Ki67⁺肿瘤细胞、HIF1A⁺/Ki67⁺中性粒细胞和FAP⁺ CAFs，形成双向免疫调节微环境。

CN07中CAFs与Tc细胞的空间邻近密度最高，且细胞间距离显著小于肿瘤核心CN01，提示在侵袭边缘存在紧密的基质屏障结构，与局部Tc细胞排斥有关。

五、基质屏障评分（Barrier Score）

定义了一个衡量CAFs在空间上阻隔CD8⁺T细胞与增殖肿瘤细胞接触程度的屏障评分。

该评分在早期肿瘤（I/II期）高于晚期（III/IV期），提示早期肺癌中CAF介导的屏障更明显（完整的促纤维增生边缘）。

高屏障评分与NSCLC患者更差的无进展生存期（PFS） 相关，在I期患者中尤为显著（HR=2.06，p=0.004）。

六、更精细的20-CN模型 vs. 10-CN模型

进一步细化得到20种CNs，识别出更多特定生态位（如缺氧增殖区、免疫调节区），其中部分也与不良预后相关。

但10-CN模型具有更高的组成纯度和谱系均一性，在生物学上更能清晰地代表肺TME，因此被选为主要分析框架。

核心结论

CNs是空间上可解析的肿瘤组织结构单元，具有明确的生物学定义和临床预后价值。

CEUs将细胞功能状态与多细胞空间结构相连接，为理解TME功能多样性与临床结局之间的关联提供了桥梁。

肿瘤进展不仅由细胞组成变化驱动，还受空间拓扑结构（如基质屏障、免疫排斥）的调控，靶向这些空间结构可能具有治疗潜力。

结果4、CANVAS平台

一、研究背景与CANVAS平台构建动机

定义的10种细胞邻域（CNs） 能有效刻画肿瘤微环境（TME）的异质性，但CODEX空间蛋白质组学技术成本高、复杂，不适合临床常规应用。

相比之下，H&E组织病理学是临床诊断的常规手段，普及度高。因此，作者开发了CANVAS平台，旨在从标准H&E切片中预测肿瘤生态栖息地，实现临床可推广的空间诊断。

二、CANVAS的两大核心模块

栖息地预测模块：利用预训练的病理学基础模型，直接从H&E切片预测CODEX定义的10种CNs（即空间栖息地）。

临床结局预测模块：基于栖息地中心的空间特征构建预测模型，实现基于H&E的患者分层。

三、模型训练与验证

构建了CODEX/H&E多模态配对数据集（224×224像素图像块），来自全切片（WSI）和组织微阵列（TMA），通过单细胞级别的共定位进行标签对齐。

训练集：8张WSI；验证集：2张WSI；独立测试集：TMA队列2。

性能结果：准确率>0.83，F1分数>0.79，Kappa系数>0.80，在多个独立队列中表现稳健。

在不同分辨率（×40和×20）、不同切片步长下均保持高性能，且优于其他病理学基础模型和传统卷积神经网络。

四、在NSCLC多队列中的应用验证

应用于TCGA、PLCO、NLST三个NSCLC队列（涵盖LUAD和LUSC）：

不良预后相关栖息地：H01（肿瘤核心）、H04（纤维化）、H06（中性粒细胞富集）

良好预后相关栖息地：H03（B细胞）、H05（浆细胞）、H08（T细胞）

这些关联在多个独立队列中高度一致，验证了CNs的预后价值的跨队列可重复性。

五、跨癌种适用性验证

在12种肿瘤类型的17个同切片CODEX-H&E样本中，CANVAS预测的栖息地谱与CODEX实测结果高度一致。

在空间转录组学（ST）-H&E正交验证中也表现一致。

进一步扩展到TCGA中8种癌症类型、3,724张H&E切片，显示CANVAS推断的栖息地具有可重复但癌种依赖的预后关联。

六、空间生态型（Spatial Ecotypes）的定义

基于TCGA-LUAD队列中肿瘤栖息地比例进行无监督聚类，识别出4种空间生态型：

C-I（髓系炎症型）：H05/H06为主，中性粒细胞丰富、固有免疫主导的TME。

C-II（纤维化型）：H04为主，纤维化，免疫浸润极少。

C-III（肿瘤富集型）：H01/H07为主，肿瘤纯度高，基质和免疫含量低。

C-IV（免疫活跃型）：H03/H08为主，淋巴细胞富集，适应性免疫活跃。

这4种生态型独立于传统转录组分类，且能显著区分患者生存结局（总生存期和疾病特异性生存期），在多因素Cox回归中仍具独立预后价值。

七、空间生态型的多组学特征

C-I：BCL2/BRAF共扩增，CYP51A1上调（胆固醇代谢改变），BRCA1/FGFR2突变，激活Toll样受体信号（中性粒细胞驱动的先天炎症）。

C-II：MTOR/RAP1GAP缺失，SOX2扩增（上皮可塑性），PTEN/JAK1/TSC1/EPAS1突变，上调EMT、MAPK信号（纤维化、免疫静默基质）。

C-III：CDKN1A/TRAF5/TGFB2扩增，EGFR突变为主（突变负荷低），上调细胞周期G2/M检查点和纺锤体基因（高度增殖，免疫浸润少）。

C-IV：HIF1A及免疫检查点位点（CD274/PDCD1LG2）扩增，EP300/MSH6/MACF1突变，激活IFN-γ反应、细胞因子-受体通路（免疫浸润强，适应免疫活跃）。

八、免疫治疗相关性

C-IV：高IFN-γ评分、扩展免疫基因特征（EIGS）、三级淋巴结构（TLS）评分，提示强适应性免疫应答，可能对免疫治疗响应较好。

C-II：激活EMT-TGF-β轴，与促纤维增生重塑和免疫排斥相关——这是免疫检查点阻断（ICB）耐药的已知特征。

C-I和C-II：虽肿瘤突变负荷（TMB）较高，但具有免疫抑制特征，可能削弱新抗原驱动的免疫原性，损害抗肿瘤免疫应答。

九、核心结论

CANVAS平台能够从常规H&E切片中准确预测CODEX定义的肿瘤生态栖息地，实现了空间蛋白质组学信息向临床常规病理学的转化。

CANVAS定义的空间生态型具有明确的预后价值、多组学特征和免疫治疗相关性，为精准肿瘤学提供了临床可扩展的空间诊断工具。

该平台可桥接单细胞空间解析度与人群规模的临床分析，推动新型空间生物标志物的发现和临床转化。

结果5、CANVAS引导的多尺度空间分析揭示了免疫治疗效益的决定因素

一、研究背景与目标

免疫治疗（ICB）亟需可靠的疗效预测生物标志物。传统标志物（如PD-L1）预测效能不足，而基因组/转录组分析将空间异质性信息均质化，丢失了关键空间信息。

CANVAS通过提取多尺度空间特征（生态多样性、区域间耦合、空间拓扑组织），建立生物学可解释的预测模型，弥补上述缺陷。

二、研究设计与特征提取

发现队列：149例接受免疫治疗的NSCLC患者。

每例提取262个空间特征，分为6大类：

组成（Composition） ：各栖息地相对丰度（10个）

多样性（Diversity） ：栖息地混合的生态复杂性（6个）

空间离散度（Spatial dispersion） ：多尺度空间统计下的聚集与分布模式（90个）

相互作用（Interaction） ：栖息地间成对邻近耦合（100个）

距离（Distance） ：栖息地间绝对空间分离度（55个）

过渡（Transition） ：基于熵的非距离空间混合指标（1个）

三、关键空间模式与免疫治疗关联

主要栖息地：H01、H04、H06、H07、H08在NSCLC中最丰富。

共定位模式：

H03与H08共定位（协调的淋巴组织）

H02与H10共定位（免疫-血管界面）

H01与H04、H08空间互斥（免疫豁免的肿瘤核心）

预后关联：

H01、H06富集 → 较差无进展生存期（PFS）

H02、H07、H08富集 → 免疫活跃生态，预测ICB临床获益

响应者 vs. 非响应者：

响应者：免疫支持性栖息地（H08）与耐药相关栖息地（H01、H04、H06）空间共占率更高，提示免疫活性与肿瘤区域之间存在更“许可性”的空间界面。

四、空间离散度与免疫治疗响应

H06和H10：高Ripley's K/L值（紧密聚集的中性粒细胞和血管区）→ PFS缩短（炎症生态位损害治疗响应）

H01高F函数值、H03/H08高核密度 → PFS延长（有利的空间组织）

响应者特征：高丰度H03/H08、高Shannon多样性、H08高核密度（淋巴富集的免疫组织）

非响应者特征：H01/H04主导、高Fisher's alpha（异质但纤维化、免疫受限的空间表型）

五、基于栖息地的空间特征签名（Spatial Signature）开发

在发现队列中，通过机器学习特征选择，最终筛选出13个特征构建预测模型：

保护性特征（β<0，有利） ：

H08与H03共定位（协调的T/B细胞组织，类TLS结构）

H01-H03空间邻接，栖息地丰富度升高（结构化的免疫生态系统）

风险特征（β>0，不利） ：

H06高频（中性粒细胞富集，N2型肿瘤相关中性粒细胞）

H04-H09相互作用（纤维化-免疫抑制空间耦合）

H05-H03频繁接触（B细胞/浆细胞介导的体液免疫组织改变）

H02与H09紧密关联（巨噬细胞富集免疫抑制生态位，M2样极化）

六、预测性能与优势

发现队列中：

6、12、24个月PFS的AUC分别为0.75、0.73、0.71

显著分层患者PFS（HR=2.42，p<0.001）

优于单一栖息地富集，优于传统标志物（TMB、PD-L1、TLS），在多因素模型中保持独立预测性（p=0.002）

在PD-L1亚组（<1%和≥1%）中均能有效分层

在EGFR和KRAS突变亚组（传统认为ICB难治）中仍能识别获益亚群

在ICB单药和ICB-化疗联合方案中均具预测价值

七、外部验证

在Cancer Moonshot Biobank（CMB）项目的40例免疫治疗患者外部验证队列中：

6、12、24个月PFS的AUC均>0.75

显著分层患者PFS（HR=4.56，p<0.01）

验证了该空间签名作为临床相关、空间信息驱动的免疫治疗生物标志物的潜力。

八、核心结论

CANVAS通过提取多尺度空间特征，揭示了影响免疫治疗获益的关键空间决定因素（栖息地组成、多样性、空间离散度、栖息地间耦合等）。

基于13个空间特征构建的空间签名能够准确预测免疫治疗PFS，优于现有临床标志物，并在多个亚组和外部队列中保持稳健。

CANVAS为免疫治疗疗效预测提供了可临床转化的空间分析工具，弥补了传统生物标志物忽略空间异质性的不足。

最后，我们来看看方法

生活很好，有你更好。