课前准备（visium + Xenium）--泛癌种三级淋巴结构空间图谱

作者，Evil Genius

随着数据的不断增多，各种空转平台的联合发文也很常见了，比如visium + xenium，HD + xenium，stereo-seq + visium + CODEX + xenium等等。

另外就是AI，Ai时代对我们来讲也是一场挑战，不过科研领域，能做的起AI的课题组也是风毛菱角。

文章更新的话，到300万字我们就停一停，目前293万。

今天我们需要汇总的内容，泛癌种三级淋巴结构空间图谱，参考文章如下

知识积累

三级淋巴结构（TLS）是肿瘤内形成的异位免疫聚集体，可调控抗肿瘤免疫。

TLS是空间有序、异质性的免疫枢纽，其成熟状态和空间背景与局部免疫组织、肿瘤通路梯度以及患者预后相关联。

TLS与B细胞成熟、抗体产生、CD8⁺ T细胞浸润增强相关，并与免疫检查点阻断疗法（ICB）的良好反应及更长生存期相关联。

结果1、ST（空间转录组学）揭示TLS在组织中的分布全景

基于TLS特征基因集计算高评分区域，再经无监督聚类、分割和筛选，最终识别出695个TLS用于后续转录组分析。

TLS的识别基因集：

TLS检出率跨癌种差异显著：TLS在肺腺癌（LUAD）、肾透明细胞癌（KIRC）、胃腺癌（STAD）、乳腺癌（BRCA）、肝细胞癌（LIHC）和膀胱癌（BLCA）中最常见；而在胰腺癌（PAAD）、口腔鳞癌（OSCC）、卵巢癌（OVCA）和多形性胶质母细胞瘤（GBM）中很少或检测不到。

TLS数量和大小在癌种间差异明显：LUAD每个样本中TLS数量最多；36例GBM样本中未检测到TLS（尽管此前有报道胶质瘤中可形成TLS），可能与该癌种ST数据覆盖和采样深度有限有关。

TLS空间分布分为三类：

瘤内（IT）：214个

瘤周（PT）：231个

远端瘤区（DT）：250个

三类分布相对均衡，但不同癌种比例各异：LUAD和宫颈鳞癌（CSCC）以IT-TLS为主；BRCA以PT-TLS富集；LIHC、结直肠癌（CRC）、BLCA、KIRC和PAAD则以DT-TLS占比更高。

结论：TLS的检出率、大小和空间组织在不同癌症间存在显著异质性，揭示了TLS在肿瘤微环境中多样化的结构模式。

结果2、TLS成熟状态在不同癌症类型间存在差异

为表征TLS的成熟状态，研究基于滤泡树突状细胞（FDC）和生发中心（GC）B细胞的经典标志物，通过无监督聚类将TLS分为三个成熟状态：早期TLS（E-TLS）、初级滤泡样TLS（P-TLS）和次级滤泡样TLS（S-TLS）。共识别出379个E-TLS（54.5%）、215个P-TLS（31%）和101个S-TLS（14.5%）。

E-TLS：早期淋巴细胞聚集，缺乏有序的滤泡结构。

P-TLS：具有分区的B细胞区和T细胞区，存在FDC但无完整生发中心。

S-TLS：具有完善的B/T细胞分区、成熟的FDC网络和定位清晰的生发中心。

随着成熟度递增，TLS特征评分从E-TLS到S-TLS逐步升高，T细胞、B细胞、FDC及生发中心B细胞标志物表达也同步上调。通过配对的空间转录组（ST）和空间蛋白质组（SP）验证（同一或相邻切片），ST定义的TLS结构与蛋白水平染色结果高度一致，包括B细胞滤泡、T细胞区、FDC网络、生发中心特征及Tfh细胞和成纤维细胞等组分。P-TLS和S-TLS中均可见B细胞滤泡区CD21⁺网状模式（FDC网络特征），并在多个空间组学平台中可重复检出，经病理专家审核确认。

空间分布方面：P-TLS偏好富集于远端瘤区（DT），而E-TLS更常见于瘤内（IT）区域；TLS大小随成熟度增加而增大，S-TLS显著大于P-TLS和E-TLS。

跨癌种分析显示成熟状态异质性显著：S-TLS富集于胃腺癌（STAD），P-TLS富集于肝细胞癌（LIHC）和结直肠癌（CRC），E-TLS富集于乳腺癌（BRCA）和卵巢癌（OVCA）。将成熟状态与空间位置整合后，进一步划分出9种TLS亚型，不同癌种各具优势亚型，例如：LIHC、CRC和膀胱癌（BLCA）以DT P-TLS为主；OVCA、BRCA和肺腺癌（LUAD）以PT E-TLS为主；胰腺癌（PAAD）和肾透明细胞癌（KIRC）以DT E-TLS为主。

结论：TLS的成熟状态和空间组织在不同癌症间存在显著差异，凸显了TLS发展的环境依赖性。

结果3、与TLS成熟相关的转录程序

1. B细胞程序的逐步演进

P-TLS中B细胞经典标志物、B细胞激活和早期分化相关基因（如BANK1、CD40）及浆细胞相关标志物（如IGHA1、IGHG1、MZB1、JCHAIN）表达升高。

S-TLS中富集生发中心B细胞、记忆B细胞和浆细胞分化程序（如PRDM1、XBP1、SDC1、CD38），反映B细胞成熟、类别转换和抗体产生增强。S-TLS核心区浆细胞相关转录本较低，可能反映终末分化的抗体分泌细胞已从成熟TLS中扩散出去。

多重免疫荧光验证（ccRCC样本）：

E-TLS中抗体分泌细胞稀疏，主要局限于TLS内，以IgG⁺为主。

P-TLS和S-TLS中抗体分泌细胞密度增加，IgG⁺和IgA⁺群体常混杂于滤泡区并扩散至TLS周围及邻近肿瘤区域，支持TLS成熟与抗体产出之间的功能联系。

2. 淋巴细胞募集和微环境组织信号增强

S-TLS中CCR7轴趋化因子（如CCL19）、CXCL13、CXCL10、IL7、IL33等表达最高，支持淋巴细胞归巢、定位及滤泡组织。

S-TLS中增殖相关基因（MKI67、BIRC5、STMN1）表达增加，反映成熟TLS内活跃的细胞扩增。

3. 免疫调节程序的参与

调节性B细胞相关基因（IL10、TGFB1、CD24、CD5、CD1D）在S-TLS中达峰值，提示适应性免疫激活伴随免疫调节程序的启动。

Xenium Prime 5K空间转录组数据（LUAD样本）证实，一群共表达IL10和CD24/CD1D的B细胞（Breg样细胞）空间上富集于S-TLS内。但IL10和TGFB1也可能来源于TLS内或邻近的髓系细胞或基质细胞。

4. T细胞程序多样化

E-TLS中T细胞激活有限；成熟TLS（尤其是S-TLS）富集记忆性、效应性和细胞毒性T细胞特征。

S-TLS中滤泡辅助T细胞（Tfh）富集（经高多重成像验证，共表达CD4、ICOS、PD-1），Tfh标志物及基因特征表达升高。

S-TLS中干扰素活性增强（干扰素刺激基因和STAT1等上调），同时调节性T细胞标志物及免疫检查点/耗竭程序（FOXP3、PDCD1、CTLA4、TIGIT、LAG3、HAVCR2）也升高，提示成熟TLS将免疫激活与调节性抑制耦合。

S-TLS中应激反应基因（HSPA1A/B等）上调，提示伴随持续免疫激活的代谢适应。

5. 抗原呈递、基质和血管区室的协同重塑

从E-TLS到S-TLS，树突状细胞标志物（CD1C、CD86、LAMP3）、DC募集趋化因子（CCL19、CCL21、CCR7）、细胞因子（IL12A、IL27）、巨噬细胞激活程序及趋化因子（CCL2、CCL4、CXCL16）均升高，抗原呈递信号增强。

血管和基质重塑随TLS成熟加剧：血管/淋巴管内皮标志物（LYVE1、CD34）、血管生成因子（VEGFA、KDR）及相关信号分子（CXCL12、CXCR4、IL6等）表达升高，组织学和空间蛋白质组学中也观察到高内皮微静脉（HEV）。

结论：成熟TLS将抗原呈递和先天免疫与基质及血管支持相耦联，共同在肿瘤微环境中维持高度有序的功能性免疫微环境。

结果4、TLS邻近性与肿瘤信号空间梯度的关联

1. 成熟状态与空间位置关联不同肿瘤通路

E-TLS：与肿瘤点中的增殖和炎症通路呈正相关，与代谢和应激适应程序呈负相关。

成熟TLS（特别是PT P-TLS和S-TLS）：与增殖和炎症肿瘤程序的关联减弱，而与免疫相关通路（补体激活、IFN-γ和IFN-α反应）呈正相关。

IT S-TLS：与肿瘤相关程序（增殖、EMT、血管生成、MYC信号）呈负相关。

P-TLS呈位置依赖性：PT P-TLS更接近S-TLS的关联谱。

2. 距离依赖性空间梯度

以瘤内TLS（IT-TLS）为中心，按空间距离建模通路活性，发现两种主导梯度模式：

“高→低”梯度（免疫相关通路）：IFN-α/γ反应、MHC II类抗原呈递、炎症信号等在紧邻TLS的肿瘤区域最高，随距离增加而递减。

“低→高”梯度（肿瘤增殖/侵袭程序）：MYC信号、G2/M检查点、EMT、KRAS信号等在TLS附近最低，随距离增加而升高。

这些空间模式在多种癌症类型中保守存在。

在组织学正常组织中的TLS分析显示：免疫相关通路仍保留邻近依赖性梯度，但肿瘤固有的增殖和侵袭梯度消失，表明TLS相关免疫激活是TLS生态位的保守空间特征，而距离依赖性肿瘤通路梯度是恶性肿瘤组织特有的。

3. TLS-肿瘤界面的配体-受体信号

通过比较IT-TLS核心与其周围50μm边缘区域的基因表达，发现：

TLS核心优先表达：TNFSF14、CXCR3、CXCR6等免疫信号基因。

周围肿瘤区域：其对应受体/配体（TNFRSF14、CXCL10/11、CXCL16）在TLS近端肿瘤点达峰值，随距离增加递减，呈现“高→低”梯度。

4. 单细胞分辨率验证（LUAD Xenium Prime 5K数据）

TLS核心富集TNFSF14、CXCR3、CXCR6转录本。

TNFRSF14、CXCL10/11、CXCL16主要定位于紧邻TLS的肿瘤或基质细胞。

这种互补的空间组织在单细胞和亚细胞分辨率下得以映射，支持以TLS为中心的局部炎症信号模式，以及TLS近端肿瘤区域内同源信号伙伴的参与。

TLS嵌入在短程细胞因子和趋化因子信号场中，其特征是免疫、肿瘤和基质区室在TLS-肿瘤界面处配体和受体的空间协调表达。

结果5、TLS成熟状态与肿瘤基因组及分子亚型的关联

1. 结直肠癌（CRC）队列

TLS在右半结肠肿瘤中更常见，与其免疫原性更强的微环境一致。

E-TLS多见于腺瘤区域，而S-TLS主要见于癌变区域。

S-TLS在高级别肿瘤中呈富集趋势（G1→G3比例递增，P=0.058）。

S-TLS仅见于KRAS野生型肿瘤，且在转移性疾病患者中更常见。

2. 肝细胞癌（LIHC）队列

TLS在肿瘤前沿（侵袭边缘）比肿瘤核心更常见。

E-TLS和S-TLS在肿瘤边界更常见，而P-TLS在肿瘤内部相对富集。

S-TLS主要见于乙肝病毒阳性（HBV⁺）患者，与既往报道（HBV相关慢性炎症可能促进肝内TLS成熟）一致。

较晚期的肝癌（BCLC B/C期）也倾向于有更高比例的成熟TLS。

3. 膀胱癌（BLCA）队列

本队列中未检测到S-TLS。

P-TLS多见于基质区域，E-TLS主要位于肿瘤区域内，分布模式与CRC和LIHC不同。

MTAP缺失（与免疫"冷"微环境相关）的肿瘤中，TLS缺失率更高、P-TLS更少。

E-TLS在化疗无应答者中呈富集趋势。

总体观察

各队列中观察到TLS成熟状态与肿瘤病理分级、基因组背景及慢性炎症病因之间有一致的趋势性关联，但统计效能不足。

成熟TLS多定位于瘤周或基质区域，而非肿瘤核心。

成熟TLS在更具侵袭性或更晚期肿瘤中出现，可能反映免疫反应伴随肿瘤进展而出现，而非一致性地提示保护性作用。

局限性：当前ST队列规模较小且异质性强，统计效能有限，需更大规模、亚型分层的队列来确证泛癌种推论。

结果6、基于H&E图像的TLS检测与成熟分类的可扩展AI框架

1. 数据规模与模型架构

共收集来自10个队列的3071张WSI，包括6个TCGA队列（LUSC、BLCA、KIRC、LUAD、STAD、COAD，共2458张）和4个独立治疗队列（OCCC、HGSOC、BRCA等，共613张）。

首先用HookNet-TLS检测TLS并进行分割，共识别出25,088个TLS。

然后用YOLOv8训练两步分类器：第一步区分E-TLS与成熟TLS（mTLS）；第二步将mTLS细分为P-TLS和S-TLS。

2. 训练与验证性能

训练数据来自3个TCGA队列（LUSC、BLCA、KIRC），共956个TLS图像，以病理专家手动标注为金标准。

采用大量数据增强策略（翻转、旋转、缩放、亮度/对比度调整、高斯模糊等）以提升跨站点、跨平台的鲁棒性。

分类准确率：

E-TLS vs mTLS：BLCA 95.1%、LUSC 90.0%、KIRC 84.0%

P-TLS vs S-TLS：BLCA 85.0%、LUSC 95.6%、KIRC 89.5%

跨癌种泛化测试（直接应用于ST发现队列，未经微调）：

E-TLS vs mTLS：准确率91.4%（AUC 0.908）

P-TLS vs S-TLS：准确率94.7%（AUC 0.928）

表明模型在多种癌种和组织背景下均具有稳健的泛化能力。

3. TLS成熟与肿瘤分期及免疫基因组背景的关系

将AI框架应用于全部6个TCGA队列（共2458张WSI）：

STAD、COAD（MSI-L/MSS）、KIRC中，晚期肿瘤的P-TLS和S-TLS比例较早期升高。

LUSC、LUAD、BLCA、COAD（MSI-H）无一致规律。

合并分析显示：I→III期TLS成熟分布显著变化，IV期与III期重叠度大，无进一步分离。提示TLS成熟常与分期相关，但并非普遍规律，主要在早中期最明显。

与TCGA既定免疫/基因组特征关联分析显示：从E-TLS→P-TLS→S-TLS，与肿瘤突变负荷、同源重组缺陷、瘤内异质性、淋巴细胞浸润、IFN-γ反应等指标逐步增强关联，提示成熟TLS存在于基因组改变更多、免疫活性更强的微环境中。

4. TLS成熟感知复合评分实现稳健患者分层

现有策略的局限性：

单纯TLS存在/缺失、主导成熟状态、或简单分为不成熟（E-TLS）vs成熟等策略，在6种癌症中均未能提供一致的预后分层（仅KIRC中S-TLS主导有显著关联），凸显癌种特异性。

新方法——TLS复合评分：

基于主成分分析（PCA），对每个肿瘤内E-TLS、P-TLS、S-TLS的计数进行对数转换和标准化，得出一个反映TLS组成多样性的连续评分。

按中位数阈值将TLS阳性肿瘤分为两组：C1组（富集P-TLS和S-TLS）和C2组（以E-TLS为主）。

预后效果：C1组患者总生存期显著优于C2组，且在所有6个队列中一致观察到此关联，优于传统分层方法。多变量Cox回归（校正肿瘤分期后）确认C1组具有独立预后价值。

5. TLS成熟与治疗反应的关联

免疫检查点阻断（ICB）治疗（OCCC队列）：

PPP2R1A突变型肿瘤（与更好免疫治疗生存相关）的P-TLS和S-TLS计数显著高于野生型。

长生存组基线TLS中成熟态富集，短生存组以E-TLS为主；治疗后时间点差异不显著，提示基线TLS复合评分可能比治疗中变化更具预后信息价值。

非免疫治疗（化疗+抗血管、新辅助化疗、抗HER2靶向治疗）：

在3个独立队列（HGSOC、乳腺癌x2）中，成熟TLS（特别是P-TLS）富集一致性地与良好治疗反应相关。

各队列中，应答者均表现为P-TLS和/或S-TLS丰度更高、成熟TLS比例更高、更倾向于归入C1组。

尽管肿瘤类型和治疗方式不同，结果方向一致，支持TLS成熟组成在多种临床情境下与治疗反应的普遍相关性。

最后，我们来看看方法

visium 质控

Xenium 5k的细胞类型识别，依据marker

肿瘤spot识别

空间距离分析

空间通讯分析

空间临近性分析

生活很好，有你更好。