Xenium 5k--胰腺导管腺癌的细胞类型分辨率预后图谱

作者，Evil Genius

AI在我们单细胞空间分析的核心作用是什么？

生物信息分析，严格来讲分析两部分，一部分是生物，一部分是计算机。

其中分析用到的代码，R，python，以及算法，包括降维聚类、PCA等，是计算机的范围。

而如何识别活细胞、基因的生物学功能，LR能够介导的空间距离等，属于生物学范畴。

Ai呢？

底层：信息汇总/检索

把海量资料整理、提取、归纳，相当于超级资料库+整理员，这是大家最直观感受到的功能。

中层：理解、推理、创作

读懂计算机，生物学语言，构思想法，思路，属于思考 + 输出的范畴。

高层：决策、预测、自动化

数据分析、趋势预判、专业辅助（医疗、工业、科研），用来替代复杂判断和重复劳动。

当AI碰撞我们的多组学，大家觉得Ai更重要，还是底层逻辑更重要。

33岁的运势虽然不在我这里，各种恶心事叠加，但是今年无论发生什么，都再坚持一年，明年不出意外，也要出去当牛马了。

不知不觉已经经历了很多年，技术这块儿也见证了很多的兴衰，我自己其实也没留下什么，自从当年感情挫折写文章转移注意力以来，写了居然有将近300万字了,不出意外的话，20号打算上课之前（哪怕取消了），超过300万字应该问题不大。

今年培训打算补上所有分析的短板，将visium HD、Xenium、CosMx、stereo-seq等分析彻底完善化，做好完整详细的总结，做相关分析遇到困境的不妨参与参与，我们一起来学习学习，大量的经验积累，或者会带给大家新的灵感。

大家要注意，生信分析不能片面强调会跑代码，底层逻辑要明白，尤其是分析逻辑和思路，以空间通讯为例，我最近总结了两篇文章，

课前准备--visium HD（Stereo-seq）细胞通讯分析策略

课前准备--低精度（visium）五大通讯思路汇总

如此多的分析策略，该如何选择？如何贴合自己的课题？这可不能说是拿到数据用cellchat跑一遍就要得到生物学结果这么简单。

明年如果出去当牛马，或许就能见到诸位了， ，不过在公司分析数据，费用对大家来说可能就成为负担了，远不是培训费用能覆盖的了， ，当我以培训的身份出现，培训的时候代码都给大家了，都是在实际项目分析中，不断锤炼优化好的代码；当我以公司生信分析的身份出现，相同的代码我来做一遍，费用应该最低10倍起翻了，这个价格公司定的，由不得我。不过也可能像周运来一样做市场，主推产品，与大家见面的时候半天时间一起讨论分析一下课题数据，时间短的话，课题并不能及时跟进了。

这个时候就体现了编制的作用了，有个编制保底，生活不出问题，任何科研的分享都不需要设置什么门槛，互利共通就成了主流。

这个世界唯一不变的就是变化，车轮滚滚向前，没有任何人能避免，我们需要做好的就是珍惜当下，勇敢面对未来。

今天我们来分享文献

知识积累

PDAC：预后极差（5年生存率约13%），病程快，多数患者在5年内到达终点。

肿瘤微环境复杂，包含恶性导管细胞、腺泡细胞、胰岛细胞及多种基质/免疫细胞，突显细胞类型特异性分析的重要性。

缺乏有效分子靶点，细胞分辨率的预后分析有助于发现治疗靶点。

数据队列

大规模队列的建立：从3103例真实世界的胰腺导管腺癌手术患者中，筛选出152例高质量样本（FUSCC-snPDAC队列），成功获得了单核RNA测序数据及完整的随访信息。

队列预后数据的优势：该队列中80.3%的患者达到了临床终点（死亡），随访完整率远高于现有公共数据库（如TCGA-PAAD的48.6%），为预后分析提供了高稳健性和可靠性。

细胞类型图谱的构建：通过对120多万个细胞核的无监督聚类，识别出5大主要细胞类型（上皮、基质、内皮、免疫、内分泌），并进一步细分为23种主要细胞类型。其中导管细胞被分为恶性（PDAC-导管）和非恶性（包括导管-1、过渡性腺泡-导管化生、胰腺上皮内瘤变）亚群。

细胞类型分辨率与预后的关联：系统生存分析发现，多种精细细胞亚群的基因特征与患者总生存期显著相关。例如，血管生成相关巨噬细胞和TXNIP⁺经典B细胞与较差预后相关，而IL21⁺滤泡辅助T细胞和LC样树突状细胞与较好预后相关。这表明细胞类型分辨率的转录组模式广泛关联患者预后。

结果1、识别细胞类型分辨的预后相关基因(crPRGs)

预后相关基因的识别方法

针对每个样本中的每种细胞类型，计算基因的平均归一化表达量，得到84万多个细胞类型-基因特征对。

筛选在至少50%样本中存在的特征，保留13万余个保守特征，并采用TPM方法进行额外归一化验证，结果与主方法高度一致。

使用Cox比例风险回归，最终识别出7,248个在至少一种细胞类型中与患者总生存期显著相关的crPRGs。

独立预后价值：

进一步的多变量Cox回归显示，其中67.6%的细胞类型-PRG特征不受临床病理变量（如TNM分期、神经侵犯、淋巴血管侵犯）影响，可作为独立的预后生物标志物。

其余特征则与已知预后指标存在显著共变。

crPRGs的预后方向与分布：

49.5%的crPRGs仅与较长生存期相关（LS-PRG），41.9%仅与较短生存期相关（SS-PRG）。

恶性导管细胞（PDAC导管细胞）携带最多的SS-PRG和LS-PRG，但其他肿瘤微环境细胞类型也携带大量高度细胞类型特异性的PRGs，重叠极少。

所有血管内皮细胞类型（动脉、静脉、毛细血管样）均偏向于与较短生存期相关的PRGs；各亚型间PRGs重叠有限，仅7个基因与所有血管内皮类型中的较短生存期相关，而STXBP1是唯一与较长生存期一致的基因。

三种内分泌细胞（胰岛α、β、δ细胞）则偏向于与较好预后相关的PRGs。

双向预后效应基因（bi-PRGs）：

共发现619个基因在不同细胞类型中具有相反的预后效应。这类基因对于指导药物靶点选择有重要意义，因为同一基因在不同细胞中可能起相反作用，影响疗效。

CD44：在PDAC细胞和CAFs中与较差预后相关，在T细胞中与较好预后相关。

ITGB1：在PDAC细胞中预示较差结局，在T细胞中预示较好生存。实验证实ITGB1敲除会显著降低CAR-T细胞的瘤内浸润，说明其对T细胞抗肿瘤功能至关重要。

ADAM17：在PDAC细胞中与较差预后相关（与既往研究一致），但在树突状细胞中呈保护性关联。抑制DC中的ADAM17会削弱DC活化T细胞的能力，提示ADAM17抑制剂可能对DC的抗肿瘤功能产生负面影响，这或许可以解释其临床试验疗效不佳的原因。

结果2、PDAC中与预后相关的基因功能通路，并比较长期生存者和短期生存者的细胞类型特异性基因特征

一、缺氧相关的代谢和促结缔组织增生通路是多种细胞类型共有的预后特征

细胞增殖并非唯一决定因素：通过对PDAC导管细胞特异性PRGs的分析，发现虽然与较短生存期相关的PRGs（SS-PRGs）的促增殖效应平均高于与较长生存期相关的PRGs（LS-PRGs），但仅约5%的SS-PRGs与细胞增殖强相关，表明肿瘤细胞增殖只是影响患者生存的多个因素之一。

Hallmark基因集的预后相关性：在50个Hallmark基因集中，90%（45/50）至少在一种细胞类型中具有预后相关性，且大多数与较差预后相关。与较好预后相关的基因集主要出现在T细胞和内分泌细胞中。

缺氧-促结缔组织增生轴是核心不良预后通路：该通路通过MTORC1信号和糖酵解介导代谢重编程。糖酵解通量在肿瘤细胞及多种基质和免疫细胞中均与不良预后相关；相反，被缺氧抑制的三羧酸循环代谢物生成通量与较好预后相关。

关键富集通路：KEGG富集分析显示，HIF-1信号、ECM-受体相互作用和黏着斑是与较差预后最显著富集的通路，且在多种细胞类型中共享。GO和Reactome分析进一步证实SS-PRGs主要富集于缺氧、ECM组织和黏着斑，并在特定细胞类型中扩展到ERBB、EGFR、NF-κB等致癌过程。

二、PDAC短期生存者与长期生存者的细胞类型差异表达基因

队列分层：将患者分为长期生存者（LTS，OS > 5年）和短期生存者（STS，OS < 1年），进行跨细胞类型的差异表达分析，鉴定出830个保守的差异表达细胞类型-基因特征。

LTS上调特征：共402个特征在LTS中显著上调。其中33%来源于内分泌细胞类型（如β细胞的SCGB2B2、α细胞的SNRPN）。另外，PDAC导管细胞中高表达的趋化因子CXCL17与LTS相关，CODEX分析显示CXCL17高表达的肿瘤细胞更靠近CD8⁺ T细胞，提示其促进抗肿瘤免疫。

STS上调特征：共428个特征在STS中显著上调，主要表达于PDAC导管细胞和毛细血管样内皮细胞。包括：在导管细胞中高表达的免疫抑制性非经典MHC分子HLA-G；以及在毛细血管样内皮细胞中上调的分泌因子SERPINA1和ANGPT2，后者可通过旁分泌信号促进PDAC增殖和侵袭。

临床转化意义：STS相关特征有助于识别不适合直接手术、应考虑新辅助治疗的患者；LTS相关特征则可用于筛选适合直接根治性切除的候选者。

结果3、细胞间通讯与PDAC患者预后的关系以及CAF来源信号对肿瘤细胞的影响

一、短期生存者（STS）与长期生存者（LTS）的细胞间通讯差异

通讯强度差异：STS组肿瘤中，多种细胞类型之间的配体-受体相互作用频率显著高于LTS组。

信号流向特征：在STS肿瘤中，内皮细胞、周细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）表现出更强的传出信号，而PDAC细胞主要作为信号接收方。

ECM-受体相互作用增强：来自内皮细胞和周细胞、指向PDAC导管细胞的ECM-受体相互作用在STS样本中显著升高。这种血管相关的ECM富集可能通过黏着斑机制为PDAC细胞的早期血管侵犯创造有利微环境，这与STS样本中淋巴血管侵犯发生率更高相一致。

二、PDAC细胞功能模块与预后的关联

功能模块识别：通过Hotspot方法对胰腺导管细胞进行转录异质性分析，识别出13个功能基因模块。

与预后相关的模块：

与较差总生存期相关的模块：代谢活化、ECM相互作用、基底样、神经调节

与较好总生存期相关的模块：脂肪酸氧化、经典型、上皮流体/离子转运体、细胞-细胞连接

基底样模块的空间定位：空间转录组分析显示，基底样转录特征优先定位于血管结构附近，与该亚型的侵袭性行为一致。通过多重mIHC证实，基底样PDAC细胞中关键黏着斑蛋白paxillin过表达，且在PDAC腺体结构与邻近血管之间存在黏着斑。

三、CAF来源信号对PDAC细胞的调控作用

CAF对PRGs的调控：通过NicheNet分析发现，与LS-PRGs相比，SS-PRGs具有更高的调控潜力，且更易被CAF来源的配体正向调控。STS组中PDAC细胞对应受体的表达也升高。

关键配体activin A：在高置信度配体中，由INHBA编码的activin A是少数可溶性细胞因子之一，主要由CAFs分泌。体外实验表明：

重组activin A刺激PDAC细胞系可上调SS-PRGs、下调LS-PRGs

activin A处理以时间和浓度依赖的方式上调磷酸化SMAD2/3表达，并增加基底样-经典型评分，提示其驱动PDAC细胞向更具侵袭性的基底样状态转变

结论：CAF来源的配体可能在调控PRG表达和驱动PDAC细胞状态转变中发挥关键作用。

结果4、预后分层细胞类型的时空分布揭示了治疗动态

一、研究设计与基本发现

样本与技术：对29例PDAC组织（含未治疗和新辅助治疗后的样本，根据RECIST标准分为部分缓解PR和疾病稳定SD）进行Xenium原位分析，共分析311万余个细胞，使用5095个基因的panel，鉴定出20种主要细胞类型。

治疗对预后相关转录组的影响：与SD样本相比，PR样本中PDAC导管细胞特异性SS-PRGs显著下调。该发现在外部公共单核RNA测序队列中得到了独立验证，治疗响应好的病例中SS-PRG抑制更明显。

二、预后分型细胞类型的空间偏好

细胞分型：基于预定义的细胞类型分辨率PRGs，将每种细胞类型进一步分为与较长生存期（LS）和较短生存期（SS）相关的亚型。

空间距离特征：SS-PDAC细胞距离LS-CAFs、LS-内分泌细胞和LS-非PDAC导管细胞更远，但与其SS对应亚型距离更近。

三、细胞邻域分析与治疗响应

细胞邻域识别：鉴定出19个具有独特细胞组成的细胞邻域（CNs）。

治疗对细胞邻域的影响：

chemoimmunotherapy治疗后，免疫富集型邻域CN0和CN4的比例增加

化疗联合免疫治疗相比单纯化疗，降低了CN15（CAF富集型邻域，其中LS-CAFs比例高于SS-CAFs）的百分比，提示治疗诱导了CAF的转录组重塑

chemoimmunotherapy组中髓系细胞富集的CN12比例增加

PR相关的细胞邻域特征：

PR样本中免疫富集型邻域（CN0、CN4、CN18）比例升高

CN6（主要由SS型PDAC细胞、CAFs和巨噬细胞组成）在PR样本中显著减少

四、空间配体-受体通讯变化

PR样本中，SS-CAF向SS-PDAC的通讯减弱，涉及胶原蛋白、CD99、CXCL、THY1和JAG1-NOTCH2等介导的相互作用，提示这些信号可能在化疗耐药中发挥作用。

五、特定细胞类型空间分布与治疗响应的关联

SS-瘤内神经：在PR PDAC中，SS-瘤内神经与SS-PDAC细胞的距离比与LS-PDAC细胞的距离更近（相比SD PDAC），提示神经微侵犯可能导致不良治疗响应。

LS-周细胞与LS-淋巴内皮细胞：在PR PDAC中，LS-周细胞常定位于LS-淋巴内皮细胞附近（10-50 μm距离）。LS-淋巴内皮细胞与LS-T细胞的距离也比与SS-T细胞更近，提示该空间结构可能促进免疫细胞浸润，增强治疗疗效。

预后分层的细胞类型空间组织会随治疗发生动态改变，可作为治疗响应的指标。细胞类型分辨率的PRGs不仅能预测长期生存，也具有指导治疗策略的潜力。

结果5、构建一个交互式网络平台ctPANDA，用于探索细胞类型解析转录组特征与患者预后之间的关联

ctPANDA是一个探索不同细胞类型中基因表达与患者总生存期相关性的平台，旨在促进临床可操作靶点的识别，为PDAC的精准肿瘤学策略提供参考。

结果6、未选择性降解的PLOD2抑制PDAC进展

一、靶点筛选策略

传统分析的局限：传统批量预后分析无法解析治疗靶点的细胞类型特异性作用，抑制某一细胞类型中的促肿瘤机制可能破坏其他细胞类型的抗肿瘤活性。

ctPANDA筛选标准：寻找在多种细胞类型中一致与不良预后相关的SS-PRGs。在所有SS-PRGs中，PLOD2和P4HA1关联的细胞类型数量最多。

选择PLOD2的理由：与P4HA1相比，PLOD2在PDAC导管细胞和CAFs（PDAC的主要细胞组分）中具有显著更高的风险比。

二、PLOD2的基本特征与预后关联

缺氧调控：PLOD2是赖氨酰羟化酶家族成员，在PDAC组织及细胞类型水平与HIF1A正相关共表达，在缺氧条件下体外上调，体内空间富集于缺氧区域。

蛋白水平验证：通过166例PDAC队列的IHC染色证实，PLOD2高表达在肿瘤富集区和基质富集区均与较差预后相关。

空间分布：PLOD2空间富集于先前定义的CN6区域（与治疗反应差和缺氧评分高相关），尤其在SS型CAFs、PDAC导管细胞和单核/巨噬细胞中表达显著升高。

三、PLOD2的力学调控机制

ECM硬度与PLOD2的关系：通过AFM和超声弹性成像证实PLOD2高表达区域硬度显著增加。ECM硬度增加通过F-actin排列调控泛素-蛋白酶体系统，增强PLOD2的表达和稳定性。

分子机制：硬度降低PLOD2的泛素化。共免疫沉淀证实PLOD2与E3泛素连接酶TRIM21结合。在TRIM21敲除细胞中，硬度和LatA对PLOD2表达的影响被消除，证明TRIM21是PLOD2稳定性力学调控所必需的。

四、PROTAC-G3的开发与验证

PROTAC设计：通过虚拟筛选163万多个小分子候选物，选择99个进行SPR验证，最终确定3个强结合化合物作为warhead，设计合成7个PROTAC分子。

PROTAC-G3的特征：以TRIM21为E3泛素连接酶配体的PROTAC-G3表现出最有效和特异的PLOD2降解作用。在TRIM21敲除细胞中该降解作用被消除，全蛋白质组学分析证实其对PLOD2具有高特异性。

五、体内抗肿瘤活性验证

PDX模型：PROTAC-G3治疗显著减小肿瘤体积和基质含量。在PLOD2敲除的肿瘤细胞和CAFs形成的异种移植瘤中，PROTAC-G3无显著抗肿瘤效果。

CD34⁺人源化小鼠模型：

化学修饰siRNA的跨物种基因消融和PROTAC-G3治疗均有效抑制人PDAC CFPAC-1异种移植瘤的生长

治疗期间小鼠体重保持相当，提示良好的耐受性

TME免疫效应：PROTAC-G3治疗显著增加T细胞浸润，CD8⁺ T细胞表现出更高的肿瘤反应性评分，肿瘤细胞周期能力降低，CAFs中炎症性CAF潜能轻度增加。

最后，来看看方法

生活很好，有你更好