CosMx文献分享--通过单细胞空间分析对携带罕见可操作突变的肺腺癌实施分层，并解析其免疫调节相关的细胞间交互作用

作者，Evil Genius

大家对即将到来的AI与多组学，做好准备了么? 基因组、单细胞空间、分子对接/分子动力学、宏基因组等，以后必将作为一个整体进行分析。

怪不得公司都不想要35岁以上的，一方面生活琐事变多，另一方面学习能力下降，也越来越明白为什么都要考编制了。

今天我们分享文献

知识积累

肺癌死亡率全球第一，非小细胞肺癌（NSCLC）占比85%，其中肺腺癌（LUAD）最常见，多数患者确诊即晚期。

EGFR突变通常导致免疫抑制微环境，对ICI反应差；KRAS/TP53共突变则与较好反应相关。

携带罕见驱动突变（频率<5%，如RET融合、MET exon14跳跃）的LUAD患者能否从ICI中获益，目前尚不明确，是亟待解决的临床问题。

结果1、携带不同可治疗致癌基因突变的LUAD单细胞空间图谱

样本收集：前瞻性收集了38例LUAD患者的石蜡包埋组织样本。其中34例携带8种罕见可操作驱动突变（如EGFR 20ins、ROS1融合、METex14、RET融合、KRAS G12C/STK11共突变、BRAF V600E、HER2突变、NTRK融合），另外4例作为参照组（2例常见EGFR突变、2例无驱动基因突变）。

分析技术：使用NanoString CosMx SMI平台进行单细胞空间分子成像，同时获得单细胞转录组和空间位置信息。

细胞数量与分型：经质控后，从38个样本中保留486,163个细胞。采用空间信息指导的聚类方法，将细胞分为六大类：上皮细胞（23.65%）、淋巴细胞（36.8%）、浆细胞（10.51%）、髓系细胞（12.46%）、成纤维细胞（12.72%）和内皮细胞（3.86%）。

结果2、基于与免疫检查点抑制剂(ICI)反应相关的分子特征对肺腺癌患者进行分层分析

计算了不同样本中主要细胞类型的比例，并进行主成分分析。不同罕见驱动突变驱动的LUAD在整体细胞组成上相对一致，无显著差异。

采用cNMF识别共享的分子程序（MPs）：

由于细胞组成差异不明显，研究者采用共识非负矩阵分解（cNMF）分析基因表达程序。

共识别出13个在所有样本中共享的共识分子程序（MPs），可分为三类：肿瘤细胞相关（MP5/6/10）、免疫相关（MP2/4/7/8/9/16/17）和基质相关（MP3/13/14）。

这些MPs与已知的泛癌种保守程序高度一致，验证了其可靠性。

筛选与ICI反应相关的MPs：

利用三个已知ICI治疗结果的LUAD批量RNA测序数据集，比较了响应者与非响应者之间的MP表达差异。

识别出4个与ICI反应相关的MPs（MP2、MP9、MP16、MP17），均在响应者组中高表达。

基于这4个MPs构建的组合特征，在TCGA LUAD队列中显示：高表达组患者预后显著更优。

患者分层结果与验证：

根据4个ICI反应相关MPs的表达模式，将8种罕见突变类型及2种参照组分为两个亚组：

ICI-MP-H组（高表达组）：包括EGFR 20ins、METex14、BRAF V600E、NTRK融合、驱动基因阴性。

ICI-MP-L组（低表达组）：包括ROS1融合、RET融合、KRAS G12C/STK11、HER2突变、EGFR 19del/L858R。

ICI-MP-H组患者（如BRAF、METex14突变）的客观缓解率和无进展生存期较好，而ICI-MP-L组患者（如RET融合、HER2突变）预后较差。

结果3、与干扰素反应过程相关的上皮细胞亚群在ICI-MP-H组中富集

两组间肿瘤上皮细胞的差异表达：

对比ICI-MP-H组与ICI-MP-L组，发现ICI-MP-H组的肿瘤上皮细胞显著高表达人白细胞抗原和干扰素反应相关基因。

基因富集分析证实，该组的MHC和干扰素分泌过程更为活跃。

上皮细胞亚群鉴定与命名：

对上皮细胞进行再聚类分析，将其分为6个亚群：E0-POU5F1、E1-ANXA2、E2-SAT1、E3-IFI6、E4-COL1A1、E5-SERPINA1。

E3-IFI6亚群在ICI-MP-H组中显著富集：

E3-IFI6亚群在ICI-MP-H组中的丰度显著高于ICI-MP-L组，该现象在空间分布上尤为明显。

通过“AddModuleScore”算法验证，E3-IFI6亚群特异性富集了干扰素反应相关基因。

高倍空间图像分析和多重免疫荧光（mIF）实验在蛋白水平上进一步证实：ICI-MP-H组中E3-IFI6关键标记基因（如PanCK和IFI6）阳性的细胞数量显著更多。

E-MP3与ICI治疗反应的关联：

对肿瘤上皮细胞进行cNMF分析，识别出5个上皮分子程序（E-MPs）。其中，E-MP3在E3-IFI6亚群中表达最高。

E-MP3评分在ICI-MP-H组中显著高于ICI-MP-L组。

临床数据验证：

分析包含明确免疫治疗反应信息的LUAD单细胞RNA测序数据，结果显示：主要病理缓解（MPR）组上皮细胞中E3-IFI6标记基因的表达水平，显著高于非MPR组和初治组。这提示E3-IFI6与免疫治疗反应存在潜在关联。

结果4、E3-IF16与髓系亚型具有空间邻近性，并在巨噬细胞中维持抗肿瘤免疫活性

空间分布分析发现E3-IFI6与髓系细胞最邻近：

计算空间共现得分发现，E3-IFI6细胞与髓系细胞的距离最近。

空间可视化直接证实了E3-IFI6细胞与髓系细胞在组织中的邻近分布。

在ICI-MP-H组中，髓系细胞的比例显著高于ICI-MP-L组。

鉴定与E3-IFI6相关性最强的髓系亚群Ma-MHC：

将髓系细胞分为3大类（巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞）和9个亚群。

分析发现，E3-IFI6与Ma-MHC（巨噬细胞MHC亚群）的相关性最强。

空间共定位和细胞间相互作用分析也显示，Ma-MHC与E3-IFI6的信号最强。

Ma-MHC的比例在ICI-MP-H组中显著高于ICI-MP-L组。

在蛋白水平上，通过多重免疫荧光验证：表达Ma-MHC标记基因、具有抗原呈递功能的巨噬细胞亚群（CD68+HLA-DRB+）在ICI-MP-H组中高度富集。

功能实验验证IFI6对巨噬细胞免疫活性的影响：

选取属于ICI-MP-L组的LUAD细胞系（NCI-H1975和NCI-H23），构建IFI6过表达细胞系。

将IFI6过表达的肿瘤细胞与M0巨噬细胞进行Transwell共培养。

结果显示：共培养后，促炎基因（HLA-DRB、IL-12、CD86、TNF-α）表达显著上调，而抗炎基因（CD163、CD206、TGF-β、ARG1）表达显著下调。

结论与机制推测：

E3-IFI6细胞与Ma-MHC髓系亚群在空间上的邻近和潜在相互作用，可能增强了ICI-MP-H组的免疫活性。

IFI6高表达的肿瘤细胞能够维持巨噬细胞的抗肿瘤免疫活性，这可能是ICI-MP-H组免疫治疗效果更优的潜在机制。

结果5、E3-IFI6和Ma-MHC细胞在ICI-MP-H组内的特定空间微环境中富集，并相互作用

识别特定的空间生态位（Niche0）：

采用空间信息指导的生态位识别策略，在所有肿瘤组织中鉴定出13个不同的空间生态位。

其中，Niche0（以上皮细胞和髓系细胞为主）在ICI-MP-H组中显著富集了E3-IFI6和Ma-MHC细胞。

58.2%的E3-IFI6细胞和43.4%的Ma-MHC细胞定位于Niche0中，表明两者在此生态位特异性共富集。

Niche0的功能特征：

Niche0与Niche9空间距离最近（后者由多种细胞类型按比例组成）。

Niche0特异性表达的基因主要富集于免疫反应和炎症反应等通路。

细胞间相互作用分析：

比较ICI-MP-H与ICI-MP-L组，共鉴定出17对显著的配体-受体对，其中12对在ICI-MP-H组中显著富集。

聚焦于E3-IFI6与Ma-MHC的相互作用发现：E3-IFI6主要表达mIF、APP和VEGFA家族相关配体，而Ma-MHC细胞中排名第一的受体信号轴是APP-CD74。

APP-CD74轴的相互作用信号在ICI-MP-H组中更为显著。

数据驱动算法验证：

采用InSituCor算法（不依赖于细胞类型分布，筛选空间相关基因），证实APP和CD74在抗原连接相互作用模块中共表达，该模块与Niche0空间重叠，并与免疫炎症及细胞外基质重塑模块密切相关。

蛋白水平与临床预后验证：

多重免疫荧光（mIF）直接可视化了IFI6⁺肿瘤细胞与HLA-DRB⁺巨噬细胞之间APP-CD74的相互作用。

在包含ICI治疗结局的LUAD RNA-seq数据中，E3-IFI6和Ma-MHC特征评分在响应者中均显著高于非响应者。

Cox回归模型显示，E3-IFI6与Ma-MHC的联合特征评分与患者更好的预后显著相关，评分越高，总生存期越长。

最后，来看看方法

生活很好，有你更好。