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研究背景

多发性硬化症(MS)是是一种中枢神经系统的自身免疫性慢性炎症性脱髓鞘疾病，是成人神经功能障碍的主要原因，复发缓解型多发性硬化症（RRMS）多发生于 MS 患者的早期发病，约占所有 MS 类型的 85%。RRMS 的发病机制仍不完全清楚，但和基因和环境都有关系。

目前已发现RRMS主要由细胞免疫、体液免疫和细胞串扰引起，其中多种细胞外信号分子发挥重要作用。许多研究也发现中枢神经系统细胞外环境中的一些分子，主要是分泌蛋白，具有免疫调节作用，它们是RRMS免疫细胞之间串扰的重要组成部分，而细胞外蛋白最具糖基化作用，细胞外蛋白可以在临床组织和一些体液中检测到，它们可能是 RRMS 的潜在生物标志物或治疗靶点。

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研究流程

• 人脑组织的MS表达谱数据从 Gene Expression Omnibus (GEO) 下载；
• 通过蛋白质注释数据库筛选细胞外蛋白质差异表达基因（EP-DEGs）；
• GO和KEGG用于分析EP-DEGs的功能和通路；
• STRING、Cytoscape、MCODE 和 Cytohubba 用于构建蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络并筛选关键 EP-DEG；
• 在 MS 患者的 脑脊液CSF 中检测到关键的 EP-DEGs 水平；
• ROC曲线和生存分析用于评估关键EP-DEG的诊断和预后能力。

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研究结果

1.筛选差异表达基因（DEGs）

为了比较MS组和对照组之间基因表达的差异，作者进行了样本之间的差异基因表达分析。

• 图A：GSE5839数据集中四个样本基因的中位数、上下四分位数、最大值和最小值基本相同；
• 图B：相关性分析显示，MS组的组内相关性更强；
• 图C：主成分分析显示MS组与对照组中心相距较远，说明MS组与对照组基因表达存在差异；
• 图D：差异基因表达分析集|logFC|≥1且P<0.05为DEGs，共筛选出540个DEGs。P值最小的前三个上调基因是CTSC、JUND和NINJ1,下调基因是ZNF506、CYP7A1和LOC101926913；
• 图E：DEGs 热图显示，DEGs 在 MS 组中持续上调或下调，这与对照组有显着差异。

2.筛选细胞外蛋白质差异表达基因（EP-DEGs）

进一步找出在MS组和对照组中差异表达的编码细胞外蛋白的基因。

• 图A：①HPA数据库中标注的编码胞外蛋白的基因与DEGs相交②Uniprot数据库中标注的编码胞外蛋白的基因与DEGs进行交叉筛③将两种方法结合起来，共获得133个EP-DEGs。
• 图B：MS 组和对照组中 EP-DEG 的火山图。用最小的 P 值标记前 10 个上调和下调的基因。
• 图C：热图：SLC4A4、IL17A、ADH6、OSM和ADCY1在MS中显着下调，聚类距离接近。

3.EP-DEG 的 GO 和 KEGG 通路富集分析

为了研究 EP-DEGs 的功能，作者对 EP-DEGs 进行了 GO 和 KEGG 富集分析。使用人类基因组作为背景参考，确定了 EP-DEGs 的生物学过程 (BPs)、细胞成分 (CCs) 和分子功能 (MFs)。

• 图4：EP-DEGs主要富集于细胞粘附的正向调节、BPs的细胞-细胞粘附调节、CCs的含胶原细胞外基质以及MFs的信号受体激活剂活性和受体-配体活性；
• 图5：MDK、LGALS1、CD74、PYCARD、BMP7、IL2、IGF1、IL13、KITLG、ANGPT4、OSM、IL3、EDIL3、TNFSF8在BPs、CCs和MFs至少两个方面富集；
• 图6A：上调基因富集于金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联反应中、细胞因子-细胞因子受体相互作用和自身免疫性甲状腺疾病；
• 图6B：下调基因富集于PI3K-Akt信号通路、癌症通路、rap1信号通路和ras信号通路。

图4：EP-DEGs 的 GO 富集

图5：EP-DEGs 的 GO 富集圆图

图6：EP-DEGs的 KEGG 富集分析

4.PPI网络的建立和Hub基因的鉴定

为了研究EP-DEGs对应的蛋白质之间的相互作用，使用STRING数据库构建了133个EP-DEGs的PPI网络。

• 图 7：EP-DEGs构建PPI网络及Hub基因的筛选；
• 表2：采用CytoHubba的10种拓扑分析方法获得Top10的EP-DEGs；共有4个基因，分别是IL17A、IL2、CD44、IGF1

图7

表2

5.IL17A、Del-1 和 ResolvinD1 水平及其与临床的相关性

为了验证鉴定出的关键细胞外蛋白，纳入 51 名 RRMS 患者和 20 名原发性头痛患者。收集患者的CSF检测 IL17A、Del-1 和 resolvinD1 水平，然后进一步分析三者与临床指标的相关性。

• 图 8A-C ：RRMS 患者的 Del-1 和 resolvinD1 水平升高，RRMS 患者的 IL17A 水平降低。
• 图8D-F：与临床指标的相关性分析显示，RRMS患者脑脊液中resolvinD1水平与Del-1呈正相关，与蛋白质和IgA呈负相关

图8

表3：RRMS患者和对照样本的临床病理特征

表4：RRMS患者的基线特征

6.Del-1 诊断疗效和生存分析

为了研究Del-1对RRMS诊断和预后的预测作用，作者进行了ROC曲线和生存分析。结果说明高 Del-1 水平与更好的无复发和无进展生存期显着相关。

• 图9A：ROC：Del-1对RRMS的诊断准确率（AUC=0.947,95%CI=0.898-0.996）高于IgG（AUC=0.740,95%CI=0.623-0.857）；
• 图9B：无复发生存时间：高Del-1组为30个月，低Del-1组为13.5个月；
• 图9C：无进展生存率：高Del-1组始终高于50%，无进展生存期为46个月；

图9：RRMS 中 Del-1 的 ROC、无复发生存、无进展生存曲线。

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研究结论

IL17A、IL2、CD44和IGF1可能是MS发病机制中的关键细胞外蛋白。IL17A、Del-1 和 resolvinD1 可能共同调节 MS 的发展，而 Del-1 是 MS 的潜在生物标志物。我们使用生物信息学方法来探索 MS 的生物标志物，并在临床样本中验证结果。该研究为揭示MS的发病机制、提高MS的诊断和预后提供了理论和实验依据。

小结

本文研究套路大部分很常见，作者根据【细胞外蛋白是RRMS免疫细胞之间串扰的重要组成部分，而且可以在临床组织和一些体液中检测到】这第一点娓娓道来，思路清晰。比较新颖的是将差异基因和细胞外分泌蛋白基因取交集获得EP-DEGs，后续的富集分析、PPI构建、临床验证等都是比较常规的套路。从中，我们或许可以得到一点启示，在一些免疫相关的疾病中是否可以将差异基因联合免疫基因进行分析呢？继续结伴热点如m6A、自噬等基因集进行分析呢？

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